动物细胞工程制药.doc

动物细胞工程制药 动物细胞工程制药的三大技术：最基本的有细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术 动物细胞的培养特征 1.比微生物细胞大，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差。 2.倍增时间长，生长缓慢，易污染，培养时添加抗生素 3.需氧少，有些需CO2 4.培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在。 动物细胞的分类； 1. 贴壁依赖性细胞:包括成纤维细胞型，上皮细胞型。生长于支持物表面。 2. 非贴壁依赖性/悬浮细胞：这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织，许多肿瘤细胞等均属于此类。细胞一般呈圆形。 3.兼性贴壁细胞有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养。如中国仓鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞 生产用动物细胞 非基因 原代细胞(primary cell) 直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液；1g组织约有109个细胞 传代细胞系(passage cell) (continuous cell lines, CCL) 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。2n;有兼性贴壁性；30-50代；无致瘤性 转化细胞系(transformant cell) 通过某个转化过程形成的，失去正常细胞的特点。由于染色体的断裂变成异倍体，获得无限增殖的能力。为永生化细胞，无限细胞系；更适于大规模工业化生产。 基因工程细胞系的构建 杂种细胞 细胞融合（仙台病毒、聚乙二醇50%、物理方法：电击法，激光法） →杂种细胞筛选 细胞融合后，除目的杂种细胞外，还有同合体细胞和未融合的亲本细胞 筛选方法：（1）营养缺陷型细胞系或抗性细胞系作为融合的亲本细胞，选择培养基来筛选（2）利用或人为制造两个亲本细胞的物理差异，如大小，密度等进行筛选（3）利用或人为制造杂种细胞与未融合细胞生化或分生能力的差异，进行筛选。 重组细胞 最多用的是CHO细胞 表达载体的构建（外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在高效表达载体内，表达载体两类：a.病毒载体，牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒和杆状病毒 b. 质粒载体——穿梭质粒载体(选择性标记+增加拷贝数基因)） →基因载体的导入 →高效表达工程细胞株的筛选(Neor: G418;tk+：胸腺嘧啶激酶 hgprt+：次黄嘌呤) 牛痘病毒感染细菌(牛痘启动子重组基因)—转化—培养—收集 杆状病毒首先和质粒一起在细胞中培养；质粒“感染”病毒-得到的重组病毒再去转染其他细胞(重组DNA病毒介导法) 附：PEG：主要用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备 制药工业中常用的动物细胞 细胞名称 来源 特性 培养条件 用途 W1-38 正常肺组织，成纤维细胞 2N BME+10%小牛血清 制备疫苗 Vero 非洲绿猴肾脏，贴壁成 2N=60 199+5%胎牛血清 增殖病毒，产疫苗，表达外源蛋白 BHK-21 地鼠幼鼠肾脏，成样 2N DMEM+7%胎牛血清 增殖病毒，产疫苗，表达外源蛋白(第二常用) CHO-K1 中国仓鼠卵巢 2N=20~22 DMEM+0.1M次黄嘌呤、胸苷，10%小牛血清，脯氨酸 分泌表达外源蛋白 Sf-9 球粘虫蛹卵组织 Grace培养基+10%胎牛血清 高校表达外源蛋白 Namalwa 肯尼亚淋巴瘤病人 2N=12-1单X染色体 RPMI1640，7%胎牛血清 生产干扰素 SP2/0 小鼠脾细胞+骨髓细胞 2N=62-68 DMEM+10%胎牛血清 生产抗体 培养： 1.温度-哺乳动物细胞最佳温度：37±0.5℃；昆虫细胞最佳温度：27℃； 2.pH：最适pH：7.2-7.4；3、氧+5% CO2的混合气体； 4.防止污染：十分重要 动物细胞培养基：1、平衡盐溶液(Hanks液，Earle液，HEPES溶液)；2、合成营养培养基(199、MEM、RPIM 1640、DMEM；基本培养基的四大类物质：氨基酸；维生素；碳水化合物；无机盐) 克隆培养(clonal culture)：即单细胞分离培养，由单细胞培养成纯细胞系 实验室培养方法：悬浮培养；贴壁培养；贴壁—悬浮培养 动物细胞的大规模培养：在人工条件下在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。 悬浮 是细菌发酵基础上改进的；主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等,也适用于兼性贴壁细胞 气升式，搅拌式反应器；产重组蛋白和单抗 微载体 60-250um的颗粒，创造大面积供细胞贴附生长；载体体积小，比重轻，在轻度搅拌下即可携带细胞悬浮于培养基 工业化生产各种疫苗和细胞产品；载体基质：葡聚糖、交联明胶、纤维素、聚苯乙烯 细胞在外 多空载体 大规模高密度的培养方法；多空