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 小鼠胚胎原位杂交 李艳梅 注意的细节 １．全胚胎原位杂交与组织杂交最大的不同在于胚胎厚度大,细胞、组织结构完整,为保证通透性差异造成杂交不足或本底过高的问题,必须通过控制消化、杂交、洗涤条件提高杂交结果的信噪比,以降低假阴性结果的出现。研究结果显示,运用小鼠胚胎进行整体杂交,对于不同胎龄的小鼠胚胎,从蛋白酶Ｋ消化时间、探针浓度、地高辛抗体浓度、洗涤强度、显色时间等环节进行优化,建立的整体小鼠胚胎原位杂交方法,具有低本底、着色清晰的特点。该方法也可以合理抑制假阳性错误的产生,提高所得结果的可靠性。 ２．目前我们所做的仍有高背景出现，需要从封闭时间等环节改进．对于不同胎龄的小鼠胚胎,从蛋白酶Ｋ消化时间、探针浓度、地高辛抗体浓度、洗涤强度、显色时间等环节进行优化,建立的整体小鼠胚胎原位杂交方法,具有低本底、着色清晰的特点。该方法也可以合理抑制假阳性错误的产生,提高所得结果的可靠性。 ３．在做原位杂交时，过氧化氢 处理时间（１－２小时），不同时期胚胎用不同浓度的Tween －２０，去污剂Ｔrix-100最好加上以达到最好的效果． ４.蛋白酶Ｋ处理时间至关重要. embryo age: duration of incubation 6.5 dpc: 4 min 7.5 dpc: 4-5 min 8.5 dpc: 6 min 9.5 dpc: 10 min 10.5 dpc: 15 min RNA Whole Mount In Situ Hybridization（一次结果是４天时间） １．Day 1: Prehybridization and Hybridization ２．Day 2: Post-hybridization washes, blocking, and antibody incubation ３．Day 3: Post-antibody washes ４．Day 4: Color development 关于原位杂交的步骤非常烦琐，但其中有许多细节要求必须好好掌握． 原位杂交最大的挑战是配制大量试剂.所以在操作时最好整理好所配试剂的步骤及用量. 切片 1.整胚在切片时,一要原色切片,另一个可以做HE染色的对照. 2. 步骤:(1).标本切开或取厚块→组织固定→固定后处理→（石腊切片法）脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→粘片→脱蜡→各级乙醇→水洗→常规染色或特殊染色→脱水→透明→树胶封片 (2)．标本切开或取厚块→组织固定（冰冻切片法）→冰冻切片→粘片→乙醇固定及水洗→常规染色→脱水→透明→树胶封片。 3.染色: HE染色在医学领域中的组织学、生物学、病理学及其细胞检查中，是必不可少的最基本染色方法 定义： 切片原位杂交 整体原位杂交 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已 知碱 基,(比如转录所用的NTP的U碱基标记有DIG辛),顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配 对的原 则进行特异 性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系 统，通过 组织化学或免疫组织学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交 信号。 分类： 石蜡切片 冷冻切片 应用： 原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测, 基因表达定位、核DNA和RNA的mRNA的排列和运输，复制和细胞的分类 (Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断 (Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定 (biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。 进行整体原位杂交的优点： 整体原位杂交具有易操作、周期短、整体效果明显等特点，是一种较新的 组织原位杂交方法。胚胎是个体发育的最初阶段，整体原位杂交作为检测 胚胎发育过程中基因表达整体效果的快速、有效手段，已在果蝇，小鼠， 线虫，斑马鱼，鸡等少数几种动物中应用。 杂交所需试剂的配置 探针的制备及纯化 杂交前胚胎的处理 杂交后胚胎的处理 显色及结果保存 杂交前探针长度和固定剂的选择 探针的长度一般应用于ISHH(原位杂交组织化学)探针的最佳长度应在50～10 个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。据报告，长500个 碱基的探针，其杂交时间约需20h左右。200～500个碱基的探针仍可应用，如 超过500个碱基的探针则在杂交前最好用碱或水解酶进行水解，使其变成短的 片段，达到实验所需求的碱基数。 　探针长度３００－１０００bp比较好的选