第28章 基因诊断与基因治疗.ppt

第三节 传染病的基因诊断 传染病的基因诊断的策略 检测病人标本中病原基因组分子 常用的技术：PCR，杂交 实例 ： 1. 甲型肝炎病毒（HAV） HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。 2. 结核分枝杆菌 用PCR技术扩增结核分枝杆菌基因组383 bp序列，再用探针杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。 4.自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy)：将“自杀”基因导入宿主细胞中，其编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞 “自杀” 。 TK/GCV系统 单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase,tk）基因编码胸苷激酶，可将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。 旁观者效应（bystander effect）“自杀基因”导入后，不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。 5.基因免疫治疗：通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。 2.抗病毒复制 （1）抑制病毒与宿主细胞结合：即阻断病毒表面抗原决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。 （2）干扰病毒基因组的转录起始和调控。 （3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。 （4）将抗病毒蛋白质基因，如2→5腺苷酸合成酶等基因，导入细胞并持续表达，可以激活核酸酶F，降解病毒RNA。 * * * * * * 反转录病毒介导的基因转移系统 反转录病毒载体：保留了病毒的包装信号ψ，而缺失包装蛋白基因；可以克隆并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。 辅助细胞株(如PA317)：由带有病毒包装蛋白基因，但缺失包装信号ψ的反转录病毒感染细胞而成。能合成包装蛋白，但本身却不能产生病毒颗粒。 反转录病毒载体的特点 ① 病毒包膜上env编码的糖蛋白，能够被哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而高效地进入靶细胞。 ② 结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。 ③ 前病毒通过LTR整合至靶细胞基因组中。 ④ 包装好的假病毒颗粒以出芽的方式分泌至辅助细胞培养 的上清液中，易于分离制备。 反转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险； 反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。 腺病毒系统 优点 基因导入效率高，对人类安全； 宿主范围广； 基因转导与细胞分裂无关； 腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。 可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注。 目 录 缺点 不能整合到靶细胞的基因组DNA中。表达时间相对较短。 宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 有两个环节可能产生复制型腺病毒。 靶向性差。 腺病毒相关病毒载体 AAV载体的特点 对人类无致病性。 可高效定点整合至人19号染色体的特定区域 19q13.4 中，并能较稳定地存在。 AAV载体的缺陷 AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段； 感染效率比反转录病毒载体低； 在40%~80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。 2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。 （2）受体介导转移技术 将DNA通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）与细胞亲和性的配体偶联，这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。 （3）基因直接注射技术 直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。实例：将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素。 基因直接注射法的优点 制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。 三、基因干预 （一）反义RNA和受体介导反义RNA技转移术 借助前述的受体介导基因转移方法，可以实现受体介导的反义RNA