单分子探测技术..ppt

单分子探测技术 报 告 人： 韩 洁 单分子探测技术的产生原因 单分子检测的基本技术（single molecules detection, SMD) 扫描探针显微技术(SPM) 光镊技术 荧光技术 单分子荧光检测的物理基础 荧光寿命 τ= 1/(Kf +ΣK ) 荧光量子产率 φ =发射的光子数/ 吸收的光子数 光漂白几率 光漂白 提供了一种“远距离操作”的方法.在不丧失优越的空间分辨率的情况下对样品扰动很小。 单分子荧光特性 单个GFP分子的荧光on-off现象 单分子荧光探测的必须条件 难点：杂散光背景比荧光信号大得多 LIF 的基本原理 单个染料分子所能发出的荧光光子数目 激光功率对荧光强度的影响曲线 共聚焦显微镜原理 昆虫脑部双重染色 单分子对荧光能量共振转移(sp F R E T ) 单对Ｄ -Ａ体系标记的单个无抑制剂蛋白的能量转移过程 展望 * 单分子探测技术产生的原因 单分子探测的主要基本技术 单分子荧光检测的物理基础 单分子荧光检测技术应用 主要内容 通常对大量分子集合体的观察测量只给出一个参数的整体平均值 , 单分子水平的测量则完全排除了这种平均效应； 单分子体系的变化过程与时间密切相关 。采用分子集合体时不能观察到这种时间相关的行为； 观察到未知领域中的新效应。 荧光分子在激发光的照射下 ,经历多次受激、退激过程后 ,往往造成分子内部结构发生不可逆的变化 ,不能吸收更多的光子而进一步发射荧光。 光漂白几率 φd = 1 / 分子在漂白前吸收的平均光子数 荧光技术特点 量子跳跃特性 取决于单分子的周围环境和猝灭途径 荧光偏振特性 单分子荧光分子具有唯一的固定吸收和发射偶极矩，因此在偏振激光的激发下，通过测量单个分子的吸收和荧光的偏振方向，可以完全确定单个荧光分子的空间取向。 Off 态主要来源于单个GFP分子的光化学诱导的长寿命的暗态 在被照射的体积中只有一个分子 与激光发生相互作用 确保单分子的信号大于背景干扰信号 (有效减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰) Rayleigh散射光 光学器件的散射光 溶液杂质的荧光 溶液的Raman散射光 光谱过滤 减小灵敏体积 时间门技术 杂散光 减小方法 在激光的照射下 ,分子吸收光子而被激发到某一激发态 ,在退激的过程中发射荧光。对于荧光量子产率较大的分子 ,其激发态的寿命为 ns量级 ,而分子通过激光束的时间为 ms量级 ,因此在连续或准连续激光的激发下 ,一个分子在通过激光束的过程中 ,将被多次反复激发而发射出大量的荧光光子，即所谓的“光子爆发”（photon burst) 两个假定：激光光束正好聚焦在探测灵敏区的中间 染料分子通过探测灵敏区的中心 P:激光束的平均功率 ω:聚焦半径 λ:激光波长 σ:光吸收截面 v:样品的流速 h:普朗克常数 NA =EAλ/hc =0.76σPλ/ωvhc a. 传统的荧光显微影像 b.共聚焦显微镜影像 原理： 标记两个不同的荧光基团,一个是供体Ｄ。另一个受体Ａ 。受体的吸收光谱与供体的发射光谱相重叠 。由于偶极 -偶极相互作用 ,能量从供体传递到受体。 通过探测能量转移效率 ,可确定两点间的距离 ,并且通过检测能量转移效率随时间的变化来推测构象的变化所引起的两点间距离的变化。 作为一门新兴边缘学科 ,单分子科学展现出蓬勃的生机。 1.单分子实验方法还有待于进一步开拓与改进。如荧光技术中时间匹配 (荧光漂白 )。 2.单分子理论还有大量工作可做。单分子实验方法的一个共同特点是信息量大,而有效地把这些信息从实验数据中提取出来就需要强有力的理论指导。 3. 随着单分子科学的发展,越来越多的新的物理效应与各种应用将被揭示出来。 这一点可以很方便地通过调整研究体系的浓度 (密度 )来达到 共軛焦顯微鏡之原理。共軛焦顯微鏡可藉由去除非焦面所產生的雜訊，以取得在樣本中不同深度之高解析度顯微影像。其主要原理可分為三個步驟來說說明：首先雷射光線可以經由物鏡聚焦成單一的光點，來照射樣品單點的特定深度；另外，由焦點反射或發散的光線還可經由物鏡聚焦成單一的光束，完全通過影像偵測器前的針孔（pinhole aperture）；最後，其他在焦點之上及之下非焦點所產生的雜訊光子則在此針孔周圍被阻擋下來，因而確保偵測器獲取焦面訊號的準確性，進而達到所欲之不同深度高解析度的顯微影像。 光从点光源发出，此光束成像在物镜的物方共轭平面上(第一次聚焦)。若被测表面刚好处于聚焦点处，则该像点又被成像到物镜的像方共轭平面--接收器的小孔上(第二