单克隆抗体技术及其应用-孟卫青.ppt

Fish Disease Research Center Fish Disease Research Center Fish Disease Research Center * 单克隆抗体技术及其应用 讲解人：孟卫青 单克隆抗体技术简介 一 二 三 四 五 单克隆抗体的制备过程 基因工程抗体制备技术 鼠源抗体人源化 六 七 抗人CD3抗体基本来源 基因工程抗体的广泛应用 已批准上市的治疗性单抗 培训大纲 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 单克隆抗体（monoclonal antibody）：针对预定抗原的同一抗原决定簇的，高度同质的，且能保证无限量供应的抗体。 单克隆抗体技术的理论依据：抗体的多样性、克隆选择学说、抗体基因的重排理论、抗体结构与生物合成机制。 一.单克隆抗体技术简介 骨髓瘤细胞 （SP2/O-Ag14 ）： 1.1 单克隆技术的原理 丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT－） 无法在HAT选择培养剂中生长 能无限地快速增殖 既不合成轻链又不合成重链 小鼠脾细胞 （B-Cell ）： 合成和分泌特异性抗体 无法进行体外长期培养 脾细胞－SP2/O融合细胞： HGPRT＋，能在HAT选择培养剂中生长 能无限地快速增殖 合成和分泌特异性抗体 HAT 次黄嘌呤，甲氨喋呤，胸腺嘧啶核苷 二.单克隆抗体的制备过程 2.1 单克隆抗体制备过程的注意事项 严格进行无菌操作，防止污染（细菌、霉菌、支原体、细胞） 根据实验的目标及时进行细胞的检测与筛选，（ELISA、 (酶联免疫吸附实验)IFA（时间分辨免疫荧光）、凝集、中和…） 对筛选得到的阳性细胞克隆进行早期单克隆（有限稀释法） 在单克隆细胞建株过程中不定期验证检测 防止单克隆细胞过度生长 ——老化 死亡 细胞融合的方法：1、仙台病毒，2、PEG/DMSO，3、电融合 2、治疗试剂 病毒等微生物的中和抗体 抗毒素—蛇毒、破伤风毒素，等 被动免疫治疗制剂 “生物导弹”，肿瘤治疗等 3、分子生物学研究工具 蛋白质等生物活性分子的纯化； 细胞生物学——组织定位； 分子病毒学——结构分析； 特定生物分子的功能研究； 1、免疫学快速诊断试剂（抗体） 细菌 病毒 肿瘤因子 特定蛋白 农残检测等 诊断技术方法： ELISA（间接法、夹心法、竞争法） 免疫荧光法 胶体金 放射免疫法 ??? ??? 2.2.单克隆抗体技术的应用 B D A C 污染：培养环境、操作 抗体分泌不足：支原体污染、细胞突变、 培养体系有问题 融合细胞不生长：PEG、血清、HAT培养基 杂交瘤细胞难以克隆化：血清质量、细胞活性 2.3 单抗制备常见问题 三.基因工程抗体制备技术 鼠源抗体人源化 01 02 小分子抗体 03 抗体融合蛋白 3.1.单抗人源组分的分类 01 02 03 04 鼠源单抗 就是指鼠分泌的抗体，其所有序列都是鼠的，注射人体易产生人抗鼠反应(即HAMA反应)。 嵌合单抗 重点解释 人源化单抗 就是通过测定鼠源抗体的序列，截取其决定簇互补区的序列移植到人抗体的编码框中表达，并经过一定的亲和力测试和筛选，最终选出仍然具有特异性识别能力的单抗。 全人源单抗 目前主要是通过转基因小鼠以及噬菌体展示文库制备的抗体，其重链和轻链都是来源于人，因此副作用更小，免疫亲和力基本保持不变，是未来的主流技术。 目录 原核表达 抗体人源化 小分子抗体 双功能抗体 易于改造 亲和力成熟 产业化 3.2 基因工程抗体优点 抗体名称 抗体种类 靶向抗原 适应症 批准日期 OKT3 鼠单抗 CD3 移植排斥 1986 Panorex 鼠单抗 17-1A 大肠癌 1995 ReoPro 人-鼠嵌合Fab 血小板受体 冠心病 1994 Rituxan 人-鼠嵌合抗体 CD20 淋巴瘤 1997 Simulect 人-鼠嵌合抗体 CD25 移植排斥 1998 Remicade 人-鼠嵌合抗体 TNF-α 炎症性肠病