外源基因在大肠杆菌中的表达调控.ppt

第六章?????? 外源基因在大肠杆菌中的表达调控 第一节??????? 基因表达的概述和基本条件 第二节??????? 在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素 第一节??????? 基因表达的概述和基本条件 一、基因表达的基本概念 二、基因表达的基本条件 三、真核基因在原核细胞中表达及调控 第二节??????? 在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素 一、启动子结构对表达效率的影响 二、表达载体的选择 三、外源基因（cDNA）中密码子的作用 四、mRNA的一级结构与基因表达 五、mRNA的二级结构对翻译起始的影响 六、mRNA稳定性的影响 七、转录终止区对外源基因表达效率的影响 八、转录后的若干因素与基因表达的关系 九、宿主选择对表达的影响 十、培养条件的控制对表达效率的影响 一、基因表达的基本概念 生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因表达是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和 mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不同。 二、基因表达的基本条件 1. 外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。 2. 插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能够识别插入的基因。 3. 外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。 三、真核基因在原核细胞中表达及调控 真核基因在原核细胞中表达及调控的特点 ㈠ 有效转录及其调控元件 ㈡ 正确转译 ㈢ 原核表达载体的构建 ㈠ 有效转录及其调控元件 1. RNA聚合酶 2. 启动子及其转录作用的启动（启动子的概念、分类） 3.转录作用的终止 4. 转录的弱化作用 ㈡ 正确转译 1.起始密码子（intiqtion codon,initiator） 2.核糖体结合位点（RBS，又称SD序列） ㈢ 原核表达载体的构建 原核表达载体的构建的要求 1.表达载体类型 2.表达载体的举例 3.包涵体表达载体 启动子 ⑴ 乳糖启动子（Lac） ⑵ Trp启动子 ⑶ Tac启动子 ⑷ 噬菌体的PL和PR启动子 ⑸ 脂蛋白启动子（LPP） 启动子结构对表达效率的影响 启动子-35区和-10区序列与通用转录序列一致，间距为17 bp，大于17bp效果差，不同产物选用不同启动子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL启动子效果好。 表达载体的选择 载体分子量不宜过大，以2.5-5.6kb为佳，高拷贝，不同产物选用不同类型表达载体。 外源基因（cDNA）中密码子的作用 细菌中基因表达对密码子有偏爱性，不偏爱的稀有密码子（AGA、AGG）表达效果差，特别当有AGA-AGG连续序列存在时表达效率低 mRNA的一级结构与基因表达 启始密码子：表达效率AUGGUGUUG SD序列：较长的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列与AUG间距一般6-12bp，4-10bp较佳，9bp最佳；SD序列的5’非翻译区，若有5’-UGAUCU，则有增强作用。 mRNA的二级结构对翻译起始的影响 mRNA形成二级结构时，可产生茎环。若SD序列、AUG位于茎环内或发夹内，转译受抑制；在茎环外则有利于转译。见表6-1 mRNA稳定性的影响 REP序列可阻止mRNA降解，偏爱密码子 也起保护作用。 真核基因在原核细胞中表达及调控的特点 只有一种RNA聚合酶 以操纵子为单位来完成基因转录 基因转录无RNA剪接功能 因无核仁、核膜，核酸均为裸露的，转录与翻译是连续进行的 转录产物在多聚核糖体上合成，同时合成多条肽链 有特有SD序列，调控mRNA与核糖体有效结合和翻译的起始 无糖基化功能 RNA聚合酶 原核细胞只有一种RNA聚合酶，当其核心酶与σ因子结合，形成全酶后，才能识别DNA上的启动子进行转录。 启动子的概念 启动子是位于结构基因上游，转录起始调控所必需的一段DNA序列，内含-35区（与σ因子结合）和-10区（和核心酶结合）的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1转录起始点开始转录，如图6-1。 转录作用的终止 由转录终止子发挥作用，凡能使转录终止的有关的DNA的序列称终止子。 强终止子：不依赖ρ因子发挥终止作用，回文序列中G/C配对多，有四个以上U，致使RNA聚合酶构象改变而终止转录。如图6-9,如图6-10 弱终止子