免疫学检测及相关实验技术.ppt

免疫学检测及相关实验技术 免疫细胞的检测 免疫分子的检测 免疫相关基因检测 免疫学检测常用标记技术 方法： E花环分离法、尼龙柱分离法 流式细胞术：分离、鉴定细胞 磁珠分离法：抗体＋磁珠 淘选法：特异性抗体包被培养皿 抗原肽-MHC分子四聚体技术：检测特异性TCR T、B细胞检测：通过检测T细胞表面CD分子，以及B细胞膜的SmIg 了解外周血T、B细胞数量和亚群的变化。 正常值：CD3+：60～80%；CD4+：55～60%； CD8+：20～0%； CD4/CD8：1.5～2.2/1； SmIg+细胞：8～12% T细胞功能检测： T细胞增殖试验：淋巴细胞转化试验有形态计数法、MTT法和同位素法三种 细胞毒试验：51Cr释放法、凋亡细胞检查法等 细胞因子检测：生物活性测定法等? 皮肤试验（体内法）：OT试验 T细胞功能体内检测法－OT试验 原理：Ⅳ型超敏反应 OT试验： 细胞免疫功能正常者，阳性细胞免疫功能低下者，阴性 应用： 诊断某些病原微生物感染 （结核、麻风） 判断细胞免疫功能 B细胞功能检测： B细胞增殖试验（同T细胞） 抗体形成细胞测定 免疫分子的检测 Ig 补体及其裂解片段 CK 膜分子的检测 免疫标记技术 利用荧光素、酶、放射性同位素等标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 三大标记技术：免疫荧光法?、酶免疫测定法、放射免疫测定法 其次：化学发光免疫分析法、免疫金标记技术Western blotting、免疫PCR法 （1）免疫荧光法? 原理：用荧光素标记抗体进行的抗原抗体反应。 二抗：抗异种免疫球蛋白抗体，如鼠抗兔 应用： 敏感性较高，尤其适合检测组织切片、细胞涂片中的抗原成分，测定免疫细胞表面的CD分子。 （2）酶免疫测定法 （enzyme immunoassay， EIA） 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 原理：用酶标记抗体进行抗原抗体反应 应用： 测定细菌、病毒、细菌毒素、病人血清中蛋白成分、细胞因子等抗原或抗体。 应用广、方法简便、敏感性高 （3）放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA) 原理：用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测的技术 常用放射性核素：125I、131I 应用：测定血清、尿液等液体中的微量抗原或半抗原物资，如激素、药物等。 敏感性很高，应用广泛。 （4）免疫印迹法－Western blotting 病毒 Class is over,thanks ! * * 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 白膜层 单核细胞 淋巴细胞 B T 吸附分离 免疫细胞的检测 免疫细胞的分离与纯化—如PBMC的分离 淋巴细胞的亚群分离 流式细胞术 flow cytometry assay;flow cytometry;FCM 荧光激活细胞分选法 fluorescence-activated cell sorting,FACS 一种细胞分选或分析技术。以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。 凋亡检测 磁珠分离法 淋巴细胞及其亚群检测 smIg荧光染色 免疫细胞功能检测 抗原肽-MHC分子四聚体技术 检测特异性TCR 抗原特异性T细胞检测 链霉亲合素 荧光素 生物素 MHC分子 抗原肽 结合CTL的特异性TCR OT试验 免疫细胞功能检测 NK功能检测：形态学、细胞毒、FACS····· 吞噬细胞功能检测：趋化功能测定； 吞噬功能测定···· 免疫相关基因检测 双抗体夹心法 灵敏度达pg/ml水平。常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及IgE等。 放射免疫检测法（RIA） 竞争法 浸于 固相载体 大小不同的蛋白 电 泳 裂 解 将各蛋白分开 待检血清 转 印 加底 物 洗 涤 酶标二抗 观察结果