当你把外源基因在宿主细胞中表达时.ppt

基因工程制药中 常用的上、下游技术 基因工程药物: 利用基因工程技术生产人体健康所需的、难以用传统方法制取的蛋白质、多肽和基因等药物。 基因工程药物包括: 基因工程治疗药物，基因工程抗体和疫苗，基因治疗药物，基因工程诊断试剂等。 基因工程药物生产的基本过程 获得目的基因→目的基因克隆→构建重组表达载体→构建、筛选基因工程细胞→工程细胞培养→表达产物的分离、纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装。 目的基因的获得 从基因组中获得 从基因组文库中获得 从cDNA文库中获得 PCR扩增法 从化学合成方法中获得 免疫法分离目的基因 选择宿主细胞的原则 安全性高、便于导入重组DNA、便于筛选克隆子、重组子能在细胞内稳定维持、不影响外源基因高效表达、具有较好的翻译后加工系统、遗传密码无特别的偏倚性、遗传性稳定，易于扩大培养、有较高的应用价值。 外源基因表达常用的宿主细胞 大肠杆菌表达系统 优点：遗传背景、代谢途径和表达机制清楚；易于遗传学操作；生长迅速；异源蛋白的高效表达;也可以分泌型表达 缺点：潜在致热源；蛋白质不分泌到培养基中；无翻译后修饰系统；异源蛋白而易形成包函体 外源基因表达常用的宿主细胞 枯草芽孢杆菌表达系统 优点：不产生内毒素；良好的分泌型； 天然构象的可能性大。 缺点：外源蛋白表达量较低；细胞内外高水平的蛋白酶。 外源基因表达常用的宿主细胞 酿酒酵母表达系统 优点：简单的真核生物，不产生病毒，内毒素；遗传背景清楚；有翻译后修饰；分泌异源蛋白。 缺点：异源蛋白表达量低；有超糖基化趋势；异源蛋白有时分泌不理想，〉30Kd不分泌，乙醇积累导致异源蛋白合成不足。 外源基因表达常用的宿主细胞 动物细胞表达系统 CHO、COS、3T3 优点：可分泌异源蛋白；正确的糖基化和翻译后修饰 缺点：异源蛋白表达量低；难以大规模生产；培养基昂贵；培养时间长；培养条件苛刻 重组DNA转化宿主细胞的途径 直接转化法、化合物诱导法、接合转化法、噬菌体转染法、电穿孔转化法、基因枪轰击法、超声转化法、脂质体介导转化法、磷酸钙转化法等。 重组子的鉴定 1. 根据重组子的特征鉴定 DNA分子的大小、酶切图谱、PCR扩 增片断、DNA杂交法、DNA测序 2. 根据转录产物鉴定 Northern、RT-PCR 3. 根据翻译产物鉴定 蛋白电泳、ELISA、Westhern、RIA 异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式包涵体型表达 包涵体形成的机理： 外原基因的表达产率过高。 无真核细胞的亚细胞器结构和稳定因子 宿主细胞的异源蛋白。 所处的环境不利于折叠。 高浓度异原蛋白造成高浓度的微环境。 异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式包涵体型表达 包涵体---生物大分子致密地聚集在细胞內，形成的高密度、不溶性的无膜的颗粒结构。 包涵体的性质---主要是表达的外原蛋白，其高级结构往往是错误的。只有在变性剂中才能溶解。要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的错误折叠蛋白质，将各个次级键打开，在体外进行蛋白质的重折叠。 异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式包涵体型表达的优缺点 优点： 外原基因的表达量极高，对宿主细胞的生长和代谢影响小 抗宿主细胞内蛋白酶降解的能力强 目标蛋白的纯度高，易于分离和纯化 缺点： 必须复性 异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式分泌型表达 分泌型表达的特点： 在N端加上能够跨膜的信号肽序列。这对重组蛋白的折叠可能有一定好处；由于跨膜是逐个进行的，蛋白间的交联机会较少；周质中的蛋白酶活性比胞质低；周质蛋白仅占菌体总蛋白的4%，使之易于纯化。但分泌到周质中的重组蛋白其构象不一定是天然构象，在周质中的重组蛋白也可能形成包涵体。 异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式分泌型表达 分泌型表达的优缺点 优点--1 可溶性表达 2 可能接近天然构象 3 Met可被切除 缺点--1 表达量低 2 纯化较困难 3 面临复性问题 异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式融合型表达 融合型表达的特点： 将高量表达的宿主蛋白基因与外源基因拼接在一起，大量表达内、外原杂合蛋白。在融合蛋白中，外源表达产物能在菌体蛋白的引导下形成较好的杂合折叠构象，封闭了部分重组蛋白上的酶切敏感位点，增加了抗酶解能力。 异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 融合型表达 融合型表达的优缺点： 优点--- 1．稳定性强 2．比单纯分泌表达产量高 缺点---1．需将融合蛋白两者分开，对酶切试剂和工艺的要求高 2．可能面临体外复性问题 异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式融合型表达 融合型表达系统的构建原则： 选择能够高效