第三章 细胞生物学的研究方法.ppt

* Xenopus Melanophore： 非洲爪蟾蜍黑素细胞 负染色?　研究以蛋白质为主要成分的颗粒状材料的最常用方法。以某些在电子束轰击下稳定而又不与蛋白质相结合的重金属盐类作为负染色剂，使之在支持膜上将颗粒材料包围，形成具有高电子散射能力的背景，衬托出低电子散射能力的颗粒的形态细节。其所成的电子显微像的反差与常规电子染色相反，即暗的背景和亮的颗粒形态的所谓阴性反差。负染色方法简便，所获得的颗粒的电子显微图像反差强,分辨率也高于超薄切片,可广泛用于研究蛋白质分子、细菌鞭毛、蛋白质结晶，以及生物膜及分离的细胞的细微结构，特别适用于蛋白质大分子及病毒颗粒结构的三维重建研究。常用的负染色剂有醋酸铀、磷钨酸钠或磷钨酸钾、 硅钨酸、 铜酸铵及甲酸铀等。用液滴法或喷雾法将颗粒材料的悬液加在载网的支持膜上，然后滴加负染色剂溶液。或将颗粒的悬液与负染色剂按一定浓度混合滴加或喷撒到支持膜上，吸去多余液体，待干燥后，即可用电镜观察。样品颗粒在支持膜上的均匀分散是成功的关键之一。染色剂溶液的pH则是成功的另一关键。一般染色剂的pH应在中性偏酸范围（pH 5～7）,但对不同种类的颗粒材料和染色剂，最适pH也不尽相同。 　　投影? 在真空蒸发器的高真空腔中,加热某些金属至熔化后，金属以细小颗粒沿直线方向蒸发出来。当金属微粒以一定入射角喷镀在载有颗粒材料的载网支持膜表面上时,颗粒向蒸发源的一面即被镀上一层金属薄膜,而背蒸发源的一面及附近区域形成无金属沉积的“阴影”，并且由于各部位散射电子能力存在着差别，这样就能构成具有强烈反差和立体感的电子显微图像。常用于投影的蒸发材料，有金、 铬、 铂、钯以及铂-铱、铂-钯、铂-碳等金属或合金。此外，还可利用电子枪投影装置使钨、钽等高熔点金属以极微细颗粒蒸发，从而获得高分辨率投影。 * * * * * * * * * * 在许多蛋白特别是转录因子中都存在磷酸化和去磷酸化作用。转录因子的磷酸化、去磷酸化可能影响：1）转录因子从细胞质向细胞核转运或相反。2）转录因子与特异DNA序列的结合。3）调节转录因子的转录激活功能区与其他因子的作用。机理：1，磷酸化增加了反式作用因子的反式激活结构域与基础转录元件或转录起始复合物之间的亲和力。2，磷酸化改变了转录活化结构域的空间构象 。3，磷酸化促使反式激活结构域与阻遏蛋白解离，或促进其与DNA结合。4，增加蛋白质分子表面的负电荷。 蛋白质磷酸化的调控机理和特点 特点：1，迅速。2，激酶催化的磷酸化可以被磷酸酶所逆转。3，能够有效地整合来自不同转导途径的信号。4，同一种激酶或磷酸酶都是多底物的，对不同转录因子的影响不同。5，蛋白因子上被修饰的氨基酸残基不同，对转录因子功能的影响也不同。 磷酸化研究方法 特异性磷酸化抗体直接证明 CIAP或OA间接证明 片段缺失突变和点突变直接证明 同位素标记 质谱分析 CIAP或OA处理细胞证明蛋白磷酸化 CIAP：牛小肠碱性磷酸酶，能够将DNA以及蛋白上的磷酸根基团去除（孵育蛋白）； OA：冈田酸，磷酸酶抑制剂（细胞处理） 片段缺失突变确定磷酸化的初步位点 点突变确定磷酸化的精确位点 (For Erk/MAPK) AKT: RXRXXS TR3: RDHLAS Motif 原理：将未被磷酸化的蛋白与被磷酸化后的蛋白用蛋白酶水解后，进行MS/MS分析，到数据库进行比对。由于磷酸化的片段上多了磷酸基团，因此其分子量将比为被磷酸化的片段要大，由此可分析出磷酸化的位置。 质谱分析蛋白磷酸化 乙酰化异常与疾病 CBP/p300的突变导致Rubinstein Taybi综合征，患者智力低下、面部畸形、姆指和拇趾粗大、身材矮小。 CBP/p300可抑制肿瘤的形成，在小鼠瘤细胞中发现CBP突变，在结肠和乳房瘤细胞系中发现p300突变。 如果突变导致错误的激活去乙酰化酶或错误的和去乙酰化酶相互作用，将可能导致疾病的发生。 甲基化CpG-结合蛋白-2(MeCP2)可募集去乙酰化酶到甲基化的DNA区域，使组蛋白去乙酰化导致染色质浓缩。MeCP2突变导致Rett综合征，患者出生即发病、智力发育迟缓、伴孤独症。 阻碍去乙酰化酶的功能，则可抑制癌细胞的增殖和分化，可用于急性早幼粒细胞性白血病, 急性淋巴细胞性白血病和非何杰金氏淋巴瘤的治疗。 蛋白乙酰化的作用是维持染色质的开放结构，因而有利于转录因子与靶DNA结合，进而促使基因的转录。 蛋白去乙酰化酶HDACs可移去H3 H4赖氨酸上的乙酰基，使带正电荷的赖氨酸残基暴露，从而增强与DNA的相互作用。 而带正电荷的赖氨酸残基与DNA之间的相互作用可限制核小体在DNA之间的移动，使启动子接近转录调控元件，组蛋白低乙酰化使染色质失去转录活性。 蛋白乙酰化的作用