现代医学实验学-成骨细胞的培养和骨折模型的制作.ppt

骨质疏松模型的建立 雌性SD大鼠 体重220～260 g，分为对照组、假手术组、去势组。除对照组外，其他各组大鼠行卵巢切除术，以l％戊巴比妥钠3～4 ml／kg腹腔注射麻醉，无菌条件下行背部肋下双侧卵巢切除，假手术组术式相同，但不摘除卵巢。术后常规饲养、自由饮水摄食 挤压挫伤模型的建立 分别将家兔四肢固定,以50kg的重物压迫家兔的左右肢,持续1小时,1小时后解除压迫和固定,家兔左右后肢出现强直,失去运动能力，活动以健肢代替，除去后肢骨折和脱臼的家兔，即为实验用左后肢软组织损伤病理模型。 成骨细胞的培养及骨折模型的制作 青岛大学医学院 阎春玲 成骨细胞的培养可广泛应用于骨折及骨损伤的疾病研究中，同时为筛选新型药物和研究机制提供离体研究。 原代培养 细胞株 成骨细胞的培养及检测 原代培养 成骨细胞的来源国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。 有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能。 有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖．代谢及钙化的能力发现，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。 小鼠原代培养 1.取新生3d以内BALB/c小鼠，断颈处死后立即投入75%酒精中消毒5min。 2.D-Hank’s液漂洗后分离颅盖骨，刮除骨膜和结缔组织，DMEM清洗颅骨骨片并剪碎 3.加入0.25%胰蛋白酶（含0.02EDTA），37°恒温消化20min，吸出消化液，之后1mg/1mlI型胶原酶37°恒温消化20min后离心（1000r/min，5min），弃上清液 4.加入含15%血清的DMEN培养基，吹打骨片（力气不要过大，但要吹打次数多一下，尽量使细胞从松解得骨片上脱落），将细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃ CO2恒温孵育箱中培养。 传代培养步骤 1.弃除旧的培养液（可以吸，可以倒，倒的时候小心） 2.用PBS冲洗一遍（加PBS清洗或换液时，不要将细胞冲刷下来） 3.用0.25%的胰酶消化液消化30-45s，在显微镜下观察，细部变圆，间距增大时，可用手拍打瓶侧壁与底壁，会发现细胞很快悬浮。 4.加入含15%的牛血清培养液终止消化 5.用吸管反复细心吹打瓶底，置离心管中后，可以用PBS或D-HANKS再吹打，可以反复几次，目的是将细胞尽可能的洗刷干净 6.离心 大鼠成骨细胞的培养 将SD 乳鼠置入75 %酒精中浸泡5min。于超净 台上取顶骨,放入PBS 皿中,刮除附着组织,待骨质发 白、透亮,再放入PBS 小瓶反复冲洗,换液3 次,以0.1 %II型胶原酶消化30min 后吸弃酶液,再以PBS 冲洗3 次 ，加入0. 1 % II型胶原酶,将骨剪成1mm2 大小,放置15min 后加入与酶液等量的含15 %小牛血清的DMEM 培养基,吸取上清液,以1 000r/ min 离心10min ,将下层液接种于50ml 培养瓶,离心液去上清后接种于25ml 培养瓶,分别加入上述培养基,置入37 ℃、5 %CO2 、饱和湿度培养箱内。每2 日换液1 次,待细胞长满后,用0. 25 %胰蛋白酶消化,按1∶2 比例传代。  1.成骨细胞的取材： 新生SD大鼠的乳鼠 新生24h-72h的乳鼠 2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中（PBS不要放太多，否则延长剪碎时间），用剪刀剪成1*1mm的组织快，越小越好（越小越能消化完全），一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml，37℃水浴中消化30min（目的是消化掉附着骨片上的结缔组织），离心去酶，加入2ml胶原酶2，水浴中继续消化1h（中间间隔晃动，使消化下来的胶原离开团块溶于液体中）。如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以加适量的PBS，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。 3.培养基问题：低糖的DMEM培养基  4.培养瓶 培养瓶在接种前，使用1%多聚赖氨酸快速包被（具体方法：每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸，尽量是底壁均铺满液体，拧上盖子，放置30min，倒掉1%多聚赖氨酸液体，用去离子水或PBS液冲洗两遍）， 包被的培养瓶，细胞很容易贴壁 。  注意问题 大鼠成骨细胞 成骨细胞的鉴定 形态学观察 碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase，ALP) 钙化结节染色 细胞株  MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨细胞），MC3T3-E1 Subclone 14（小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14） MC3T3- E1 细胞 体外培养成骨细胞的影响因素 物理因素 1 电离