结核病的实验室诊断技术和应用.ppt

而且，针对涂片等方法不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌导致误检的问题，TB-SAT可以区分结核分枝杆菌和至少18种非结核分枝杆菌。 * 从这张图我们看到了三条曲线，都代表了不同的病原体感染前后各标志物的含量变化，蓝色的为DNA，黄色的为RNA，绿色的是抗体。我们可以看到，在感染初期DNA与RNA的浓度迅速上升，而抗体则经历了一段时间的窗口期，浓度才上升。所以病原体的核酸在感染初期就可以被检测到，而抗体检测不到。而经过治疗以后，病原体死亡，RNA浓度迅速下降，而DNA由于其降解速度较慢，仍然能被检测到，所以DNA无法实时反映出病情变化，同样由于经过感染，患者体内的抗体浓度保留在一定的水平，同样也无法实时反映病情。所以相比于其他两种标志物，RNA更能实时反映病情，缩短窗口期，避免假阳性。 * 而且，针对涂片等方法不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌导致误检的问题，TB-SAT可以区分结核分枝杆菌和至少18种非结核分枝杆菌。 * 中国防痨协会的知名结核病诊断专家也指出，TB-SAT可以显著提高结核分枝杆菌的阳性检出率，对于早期发现传染性肺结核患者，控制结核病传染源有极其重要的意义。 * * 多数研究报告提示：耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。总体上是基因一个或几个核苷酸突变（表现增加、缺失、替代），造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列，影响药物与靶位酶结合产生耐药。 * 采用PCR+反向点杂交技术，通有带有生物素的特异性引物与样品DNA进行扩增，之后再与膜条上的探针进行分子杂交，最后显色，肉眼就能对分枝杆菌菌株的鉴定 * DNA用于临床检验的不足 “死菌检测呈阳性”，与临床相关性差 不能区分“潜伏感染”“活动性感染” 易交叉污染 反应易受抑制 NASBA（国外） TMA（国外） SAT（国内） 四、常见的RNA检测技术 SAT技术是将核酸恒温扩增和实时荧光 检测相结合的一种新型RNA检测技术。 TB—SAT 检测技术 TB-RNA释放 恒温扩增 实时检测 超声波（300W） 15 min 痰液预处理 42℃ 40 min 与反应液混合 60℃10 min 42℃ 5 min TB-SAT操作流程 50 μl 稀释液 全程2小时，会做PCR，就学的会SAT TB-SAT检测技术优点 RNA诊断技术的优势 灵敏度高：RNA ≥ DNA拷贝数 与临床相关性好：区分“死活菌”： 减少抗生素滥用 可以诊断“活动性感染”： 活动性感染：RNA转录活跃 潜伏感染：RNA不转录 不易污染：靶标和扩增产物都是RNA TB-SAT检测区分MTB和NTM 结核分枝杆菌复合群（MTB）： 人型结核分枝杆菌 牛型结核分枝杆菌 非洲型结核分枝杆菌 非结核分枝杆菌（NTM）： 研究表明，TB-SAT可以区分如下NTM：堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、海分枝杆菌等18种 Novel Real-Time Simultaneous Amplification and Testing Method To Accurately and Rapidly Detect Mycobacterium tuberculosis Complex J.Clin.Microbiol.2012,50(3):646.DOL:10.1128/JCM.05853-11. 活菌检测技术，可用作肺结核治疗效果评估 据文献报道：每个结核分枝杆菌含有约2000个拷贝rRNA 研究表明：rRNA与结核分枝杆菌的生活力有着很好的相关性， rRNA可以反映结核分枝杆菌的死菌活菌状态 研究表明：在用药治疗期内，随着结核分枝杆菌的死亡，rRNA大约在7天左右时间全部降解。而DNA含量几乎保持不变 VIVIAN JONAS,et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Sept.1993, p.2410-2416 CLAUDIO PIERSIMONI, et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.1997, p.193–196. GABRIELLE M. E. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 1994, p. 1959-1965 免疫法常有既往感染问题 SAT更有利于治愈判断 窗口期 时间示意 相对浓度示意 抗体 RNA DNA 病原体感染前后各检测靶标的含量变化 死菌的RNA快速降解，有助治愈判断 用药 治疗 DNA需要一段时间降解 RNA快速降解 相比DNA,RNA检测能更好的体现疗效 服用利福平和氧氟沙星后，第三天和第七天DNA和RNA的滴度变化，相比 DNA,