免疫电泳详细教程.pptVIP

免疫电泳 免疫电泳的各种方法是电泳和免疫沉淀的结合应用。通过这种技术，可以对复杂样品如血清、细菌裂解液中的抗原进行定量和定性的分析。浓度为1-2%的琼脂糖凝胶可以作为电泳和沉淀的基质。例如pH值范围在6-9的硼酸盐溶液可以用作反应的缓冲液体系。必须要注意缓冲液的离子浓度不能太高，另外，电泳对温度的变化也是很敏感的。同时我们也要避免凝胶的融化以及蛋白的变性，因为这有可能会使其失去抗原性。 简单免疫电泳 简单免疫电泳只追求单纯的定性分析。它尤其适用于在复杂样品中同时检测多种抗原。对抗原的分离是基于其电荷的差异，因此该技术提供了更好的解决方法。因为抗原在免疫电泳的过程中扩散占用了较大的空间，所以它的灵敏性不是太高。 和琼脂平板法相似，简单免疫电泳的各种沉淀线也代表着抗原的同一性、部分同一性和非同一性。如果电泳分离的两抗原其沉淀线距离很远相互没有接触，那电泳的时间就要减少一下了。 如果要验证一个已知抗原的话，可以将样品和参考标准抗原平行加样进行电泳。然后将抗血清加入到两者之间的加样槽中进行免疫扩散即可。 交叉免疫电泳 交叉免疫电泳是简单免疫电泳的一种提高。相似的，样品中的抗原依据电荷不同经电泳后被分离，然后使已经分开的抗原成分与原电泳方向呈90°角的方向在含有抗体的琼脂糖凝胶中进行二向电泳。抗原和抗体根据各自所带电荷的不同在胶中进行迁移。 由于大多数抗体的等电点大约为中性pH值范围，因此利用中性缓冲液体系进行电泳时，抗体分子不动或者移动很小。因为抗原在胶中的迁移是根据其带的净电荷，所以它们的等电点必须与缓冲液体系的pH值有较大的差异。如果这些条件都满足了，如带负电的抗原其与抗体结合的沉淀线便会在适当的区域产生并快速向正极移动（形成逐渐向正极移动的沉淀峰）。除非再也没有抗原可以进行扩散，这时沉淀峰的移动才会停止。 利用胶中连续的抗体浓度，峰的最大高度是和提供的抗原的浓度呈比例的。根据已知浓度的各种标准抗原，交叉免疫电泳可以定性和定量的分析抗原。 除了可以进行定量分析，交叉免疫电泳相对于简单免疫电泳仍有很多的优势：它提供了更好的解决方案，并且可以明显的快速进行。第一向分离抗原的电泳大约需要3小时，而接下来的扩散需要30-90分钟就可以了。 火箭免疫电泳 火箭免疫电泳只追求对抗原进行定量分析。可以精确、简单、快速的定量分析0.5-2μg的抗原。 在这个过程中，我们在1-2%的琼脂糖凝胶中（厚约1.5mm）打上几个大约3-8mm长的小洞，待测样品和稀释不同程度的标准抗原被加入这样的小洞以建立标准曲线。和交叉免疫电泳的第二步类似，抗原在含有抗体的胶中进行电泳，很快火箭样的沉淀线形成并向着电极的方向移动直到稳定下来。 在抗体浓度恒定的胶中沉淀线的最大的迁移距离和抗原浓度的关系是线性的。由已知浓度的标准抗原溶液可以得到标准曲线，沉淀线的迁移距离和凝胶中抗血清的浓度是成反比的。因此降低胶中抗血清的浓度可以增加该方法的敏感性。 只有在抗原和抗体具有不同的等电点并且伴随不同的迁移速率，火箭电泳才能进行。如果不满足这个条件，可以由氨甲酰化抗原来降低其等电点，方法是这样的： 一体积抗原溶液和一体积KCNO(2mM)在45℃孵育30min。待冷却以后，该混合液用电泳缓冲液调整到要求的浓度，然后加入到胶中即可。 7.1.5其局限性及其重要性 经典的免疫沉淀的方法已经从实验室里逐渐的消失了。简单免疫电泳基本被Western Blot方法所替代，定量分析方法比如放射免疫扩散、火箭免疫电泳越来越多的被更灵敏的方法如ELISA、RIA所代替了。主要原因除了其灵敏性低，还有一个原因就是其反应时间较长。 如果实验对敏感性没有特殊的要求，并且如果不是要检测半抗原，可以考虑这些经典免疫沉淀方法。它们操作简单，并且不会造成大量的物质消耗，不需要昂贵的ELISA等仪器。 7.2当今的免疫沉淀 免疫沉淀现在更多的被用作一种分析方法。利用该技术，细胞大家族里面的某些特定抗原能够被检测出来。 另外，单克隆抗体的抗原特异性也可以用免疫沉淀的方法来测得。利用现代免疫技术，不需要考虑抗原表位与抗体互补位间的平衡，而这在传统方法里是相当重要的。抗体通常被加到过量的抗原中。另外单克隆抗体也可以用此方法。因为抗体被交联到了一个固定相上，如琼脂糖凝胶，免疫沉淀复合物可以通过简单的离心而分离，然后便可以对其进行分析。 7.2.1沉淀基质 我们用什么来沉淀复合物呢？在免疫学的研究中，经常会用到IgG与细菌蛋白A、蛋白G的特异性结合。这些细菌蛋白目前已经商品化用作与琼脂糖凝胶结合。它们非常好用，因为只需要电泳就可以完成免疫电泳。IgG分子与这些蛋白的结合是通过其Fc端，因此其抗原结合位点都是可用的。这种方法在灵敏性及检测量上都有很明显的提高。将琼脂糖凝胶提前活化了，例如抗小鼠IgG琼脂糖凝