目的基因的连接、转化、涂板培养.pptVIP

α-互补 标志补救（?-半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H ?片段 COOH ?片段 lacZ （LacZ基因 N端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 C端序列 LacZ酶 X-gal Lac Z 蓝色化合物 α-互补蓝白筛选 lacZ β-半乳糖苷酶 分解乳糖 i P O 调控蛋白P 大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统 a-互补显色反应（蓝白斑筛选） lacZ - β-半乳糖苷酶- 分解乳糖 i P O 调控蛋白P α-肽段 分解X-gal 产物呈现蓝色 诱导剂IPTG β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 分 分离目的基因 切 限制酶切割目的基因与载体 接 连接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体、转化子 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 * 氯化钌（liao） * 倒置培养原因：温育的时候，培养基的水分要蒸发，形成水珠，如果正放的话水珠集聚在培养基平面上会影响菌落的生长，所以要保证培养基的干燥，就得倒置培养. 这是一点,还有就是便于拿取,大下小上,不会打掉.也防止外物掉在培养基上. 阳性菌落小量扩大培养，即在5ml培养基中培养，收集菌体，提质粒，进行鉴定：酶切、PCR、测序等。确定是是目的基因插入后，再大量扩大培养，进行表达等操作。 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 * 目的基因的连接、转化、涂板培养 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 * 掌握目的基因的重组连接原理及方法。 理解蓝白斑筛选鉴定的原理 熟悉重组DNA分子转化受体细胞的基本思路和方法 目 的 实验总设计 分---PCR分离目的基因 切 接---目的基因与载体相连 转---转入宿主细胞 筛---筛选阳性重组体 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 接---目的基因与载体相连 原 理： DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个或者几个A碱基的特性 利用T载体3’末端的T碱基和PCR产物的A碱基互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接 是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。 pMDTM19-T Vector 476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5’-序列，表达半乳糖苷酶的α片段。 LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。 lacZ之内是M13的多功能连接器。 EcoR V ? ? pMDTM18-9 Vector 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 目的基因（PCR产物） 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5 ′ 3′ T(T)nT 3′ T(T)nT 5′ 5′ 3′ A(A)nA 3′ A(A)nA 5′ λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 16oC 重组体 主要试剂 pMDTM19-T Vector （TaKaRa公司） PCR扩增产物 T4 DNA连接酶 10×T4DNA连接酶缓冲液 反应体系 pMDTM19-T Vector连接试剂盒使用说明（TaKaRa公司） ① ② pMDTM18-T Vector 0.5μl 0.5 μl PCR扩增产物 1 μl(4.5μl) Control Insert DNA 1μl ddH2O 3μl (0 μl ) 3μl Solution I 5μl 5μl 总体积 10μl