TRIZOL法提取总RNA实验总体安排.ppt

实验总体安排 ? 1．大鼠GAPDH基因的钓取、克隆和鉴定： 大鼠肝细胞总RNA的提取，凝胶电泳检测 GAPDH基因的RT-PCR扩增（普通聚合酶） RT-PCR产物的胶回收 连接入T载体、转化（GAPDH基因的TA克隆） 挑单克隆，摇菌过夜、提质粒 酶切鉴定，电泳检测 ;专题;TRIZOL法提取总RNA;简介;Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。在酚和氯仿作用下离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，用异丙醇沉淀火的RNA;RNase;RNase处理;从组织中提取RNA;步骤;注意事项;电泳检测;琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系???因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。;注意事项;实验步骤;;上样;;电泳检测结果：;核酸定量;?在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。  DNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍数× 50/1000（ug/ul） RNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍数 ×40/1000（ug/ul）??? ?? ;故根据OD 260 /OD 280的比值可以估计核酸的纯度： DNA样品的比值为1.8， RNA样品的比值为2.0。若DNA样品的比值高于1.8，说明样品中含有RNA污染， 若RNA样品比值高于2.0，则提示RNA 有降解。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。 ;实验步骤;RT-PCR;RT-PCR;反转录PCR(RT-PCR); RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物（随机引物:Oligo dT);实验步骤;AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’;实验步骤