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S M A R T 技术 ;背景介绍;技术历程;SMART(Switching Mechanism At 5‘ end of the RNA Transcript(SMART)技术的出现是一个新的里程碑。 原理：在合成cDNA的反应中事先加入的3末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。 ;这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。 ;几个采用SMART技术的产品（Clontech） ;SMART PCR cDNA Synthesis Kit ;试剂盒提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引物、合成第一链Buffer、dNTP、DTT、Advantage PCR Kit(15rxns)和纯化cDNA用的纯化柱和对照RNA在内的试剂。 首先利用专利的SMARTTM寡聚核苷酸合成第一链，再利用LD PCR技术生产高质量的全长cDNA双链。比较传统的GublerHoffman cDNA合成法，SMART技术能得到更高比例的全长克隆，得到完整的mRNA 5’端非编码区。;SMART PCR cDNA Synthesis Kit;SMART PCR cDNA Synthesis Kit;SMART PCR cDNA Synthesis Kit;SMART cDNA Library Construction Kit ;SMART cDNA Library Construction Kit;这个试剂盒提供的载体也很有特色：双链cDNA与噬菌体载体lambda Triplex2 的左右臂连接后再与包装蛋白进行包装反应，进而侵染大肠杆菌形成cDNA文库。 lambda Triplex2载体即具有噬菌体载体的优点----高滴度文库，蓝白斑筛选，表达量的调节，又可以通过简单的方法???粒化后进行亚克隆。 该载体的特点： 能极其容易的质粒化 多克隆位点上游包含两个翻译起始位点和（dT）13slip，这种特殊设计可用3个不同的表达框架分别同时表达一段插入的DNA。这样就保证插入的片断的正确的表达产物能被筛选出来而不会漏掉。