液质联用在蛋白质分析中的应用.ppt

高效液相色谱与质谱连用在蛋白质定量分析中的应用  蛋白质对生命的重要性 蛋白质是组成人体重要的成分之一，是生命的物质基础。 与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、 物质运转、遗传、生命的起源和进化都有着密不可分的关系。 蛋白质对肝脏、肾脏、胶体浸透压、水肿等都起调节作用。 蛋白质支持人体的神经和生理功能、大脑的兴奋与抑制，都离不开蛋白质的支持。 传统蛋白质定量分析方式 凯氏定氮及分光光度法 染料结合法 紫外可见吸光光度法 荧光法 蛋白质铍试剂体系的吸光光谱 金属离子染料结合法 蛋白质结构及改良的双缩脲反应 蛋白质功效比值的测定 HPLC-ICPMS对蛋白质进行定量分析 液相色谱与质谱连用技术，将有高分离能力及应用范围广泛的液相色谱法与具备高灵敏度和选择性并能提供物质分子量、元素组成及结构信息的质谱法结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。 HPLC-MS对蛋白质进行定量分析 分析原理： 保留时间对蛋白质进行定性分析 蛋白质中特定元素在质谱中的信号强度对蛋白质进行定量分析 硫元素存在于大部分蛋白质中，高分辨率质谱能够准确定量分析硫元素，将硫元素作为蛋白质中的代表元素进行定量分析，减少了化学反应步骤，分析简便快捷。 二、高效液相色谱及其在蛋白质分析中的应 用简介 HPLC分离原理 高效液相色谱是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程 ，它借溶质在两相间分配系数、亲合力、吸附能力、离子交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质进行分离。 HPLC分析蛋白质不仅简便快捷，而且选择性好，分离效率高，检测灵敏度高。 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪: 液体输送系统、 进样系统、 色谱柱 检测系统 高效液相色谱分离蛋白质的优势 ① 与结晶、过滤等传统分离方法比较，它可以提供更佳的分离效果，并且一次可以得到2个以上的高纯度组分。 ②分析速度快，一般可在30min内完成。 ③样品回收简单，检出范围达ng或pg级。 ④方法灵活机动，只需更换色谱柱和检测器，便可适用于不同的分离要求。 蛋白质在物理、化学及功能上等特征上的差异为蛋白质的分离检测提供了基础。根据蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性、功能等特性以及蛋白质的来源、实验室要求等可以选择不同的模式来分离目标蛋白质。 HPLC分离蛋白质的几种模式 　 反相高效液相色谱(RP-HPLC) 　 高效离子交换色谱(HPIEC) 高效凝胶过滤色谱，又称排阻色谱 　 法（SEC） 高效亲和色谱（HPAFC） 高效疏水色谱（HIC） 三、高效液相色谱的技术要点——色谱柱和流动相 三、高效液相色谱的技术要点—色谱柱和流动相 色谱柱的关键内容是制备高效填料。近年来的高效填料是使用了小颗粒（10μm、7μm、5μm、3μm）的无机氧化物，如硅胶，二氧化锆，三氧化二铝和有机多孔共聚微球作基质。在这些基质上键合各种化学基团或涂渍各种聚合物，形成各种具有选择性作用的高效固定相。 HPLC固定相举例 以硅胶作为基质的反相色谱填料 以其他氧化物作为基质的反相色谱填料，多以氧化铝、二氧化钛和二氧化锆为主 无孔单分散填料 有机高聚物填料、 灌注色谱填料 手性固定相填料 HPLC色谱柱的填充 干法填充-适用于大颗粒 湿法填充-适用于小粒径（流程图如右图所示） 高效液相色谱的流动相 HPLC对流动相的基本要求是： ①与固定相不互溶，不发生化学反应。 ②溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 ③必须与检测器相适应。 ④流动相的粘度要小，可以降低色谱柱的阻力而提高柱效。 ⑤纯度高，不含机械杂质。 流动相的选择 常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。 LC／MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸铵＜10一5 mmol/l。 送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。 色谱条件的选择 色谱分离条件 色谱柱 流动相 梯度或等度洗脱 流动相速度 四、蛋白质分离中HPLC条件参数举例 四、蛋白质分离中HPLC条件参数举例 有利于蛋白质分离的条件于 1970年首次提出，即： 低 pH值流动相 室温或较高温度 使用乙腈或异丙醇作为有机部分 三氟乙酸(TFA)作为离子对试剂 ，是反相色谱中最常用的添加剂。 蛋白质的保留性质和选择性还与键合固定相的性质