棉花体细胞胚发生过程的组织细胞学观察.docVIP

棉花体细胞胚发生过程的组织细胞学观察 曹景林, 张献龙*, 杨细燕, 邓锋林，谭家福，郝娟 (华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 ) 摘 要：以陆地棉品种 下胚轴为外植体诱导愈伤组织，并以介于目筛之间的胚性愈伤细胞团为材料进行单个细胞团培养，采用石蜡切片法观察棉花愈伤组织诱导和分化过程及体细胞胚发生和发育过程。结果显示棉花胚性愈伤组织有下胚轴两端发生、内发生、非胚性细胞转化、外发生和腺体处发生种形成途径，其中两端发生和内发生是主要的形成方式；棉花体细胞胚存在单细胞起源，多为表面发生。棉花体细胞胚发育过程中最关键的事件似乎是极性的建立、顶端分生组织的形成以及前形成层的分化和生长轴变化。球形胚时期表皮原层的分化标志着体细胞胚结构分化的开始。初始前形成层的形成是体细胞胚形态转变的第一个信号。球形胚内部等径细胞轴向延长，接着前形成层生长轴发生变化，这些是心形胚或椭圆形体胚中的重要事件。鱼雷形胚基本分生组织中液泡的出现开始了组织分化的过程。对一些停滞发育的球形胚和鱼雷形胚的解剖检查表明，极性建立可能是决定体细胞胚能否萌发的关键因素。 关键词：棉花；体细胞胚胎发生；组织细胞学 基金项目：教育部新世纪人才支持计划() 作者简介：曹景林（），男，博士，遗传育种专业，现在湖北省烟草科研所工作。 *通讯作者（ ）:张献龙，男，教授，博士生导师。 ( .) -lin, , , ( , , , , ) ： , – , , . . , , , , . , . , . , , . . . . . . : ; ; 体细胞胚胎发生是指与原始组织不存在微管束联系的非合子细胞发育成一个类似合子胚的极性结构的过程[]，它经历了与合子胚发生类似的关键阶段：球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶成熟胚[]。这个过程也是展示植物细胞如何首先分化然后重新决定向胚性途径发展而呈现全能性的一种方式[]。作为世纪后期植物组织培养中的一个重大发现和突破，体细胞胚胎发生体系在植株再生、病毒脱除、细胞融合、基因工程等领域中具有广泛的应用。然而，由于不同物种，甚至同一物种的不同基因型在体细胞胚诱导、体细胞胚的同步发育以及体细胞胚的成熟等各方面对培养条件的要求不同，而使其潜力难以充分发挥。近年来，棉花体细胞胚胎发生和再生技术得到了明显改进[]，但对棉花体细胞胚胎发生机制的研究较少[]。棉花的再生过程主要是通过诱导愈伤组织产生体细胞胚,由体细胞胚发育成再生苗。在此过程中了解愈伤组织和体细胞胚的发生及生长过程对研究棉花体细胞胚的发生机理及进一步改进再生体系有很大帮助。目前，尽管有一些关于棉花体细胞胚胎发生过程的显微观察报道[]，但系统的组织学研究报道尚未见到。因此，本研究采用石蜡切片技术，研究体细胞胚的发生特征，以期从细胞学水平上认识体细胞胚的发生特点，为进一步提高再生效率研究提供依据。 材料与方法 愈伤组织的诱导和继代培养 以陆地棉品种为供试材料，由华中农业大学棉花育种室提供。棉花品种的成熟种子经去壳消毒后，种植在培养基上，于±1 ℃下暗培养 左右，获无菌苗。取无菌苗下胚轴切成 左右的小段，平放于愈伤诱导培养基(无机盐，有机物， μ· ，μ· ， () ·， () )上。诱导 左右将愈伤组织转移到减半的愈伤诱导培养基上继代培养。以后每 继代次，直至愈伤组织发生肉眼可见的胚分化。把胚性愈伤组织转入分化培养基(无机盐,无而加倍，有机物， μ· ， μ· ， () ， ()， ())，每 继代次。愈伤的诱导和分化培养于±℃，光照强度(冷光源)μ··，每天光照 胚性愈伤组织的悬浮培养 胚性愈伤组织继代培养～次后，转入不含激素和的分化培养基（补加 () ）中悬浮培养。首先选取生长稳健、状态疏松的小米粒状米黄色胚性愈伤组织转入盛有 培养基的 锥形瓶（约 瓶）中，温度±2℃、 振荡培养 ，以获得分散的细胞培养物，然后过目筛，去除大颗粒。然后将每 ()胚性愈伤转入盛有 新鲜培养基的锥形瓶中，继续在温度±2℃下， 胚性细胞团的固体培养 胚性愈伤组织悬浮培养 后，再次过目筛，滤液再过目筛，收集筛上部分，重新悬浮于新鲜培养基中，用一个长而尖嘴的吸管吸取含