工业微生物变育种.ppt

营养缺陷型菌株的筛选 野生型菌株（wild type strain） ：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株 营养缺陷型（auxotroph)：野生型菌株经过人工诱变或自然变异失去合成某种必需营养（氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子(生长因子)才能生长繁殖 原养型（prototroph）: 营养缺陷型菌株经过回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求与野生型菌株相同 营养缺陷型菌株筛选有关培养基 基本培养基（minimal medium, MM）：仅能满足野生型菌株生长需要 完全培养基（complete medium, CM）：凡可以满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基 补充培养基（supplemental medium, SM）：只能满足相应营养缺陷型菌株生长需要，是在基本培养基中加入了相应营养缺陷型菌株所不能合成的营养因子。 5.1 营养缺陷型菌株的选育 营养缺陷性突变为（单一）基因突变，是产生某种营养因子的代谢途径中某个关键酶合成基因突变造成相应酶不能产生或不能发挥作用，从而造成相应营养因子不能产生 诱发突变 筛选1步：淘汰野生型菌株 筛选2步：检出缺陷类型 筛选3步：鉴别缺陷种类 5.1.1营养缺陷型的诱变 多用亚硝基胍（NTG）、UV、亚硝酸等做诱变剂；其中亚硝基胍（NTG）诱发营养缺陷型的频率极高，一般可达10％；电离辐射损伤大，一般不适宜做营养缺陷型诱变剂；用完全培养基做后培养 5. 1.2 淘汰野生型菌株方法1：抗生素法 细菌： 用加有青霉素的基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，野生型菌株因为繁殖产生的子细胞不能合成正常细胞壁而死亡，而对不能繁殖的营养缺陷型细胞因为在基本培养基中不能繁殖而得以保留 具体方法和步骤见P176 5. 1.2 淘汰野生型菌株方法1：抗生素法 酵母菌： 用加有制霉菌素基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，制霉菌素抑制真菌细胞壁中甾醇合成，从而使繁殖中的细胞产生的子细胞死亡，保留营养缺陷型细胞 方法2：菌丝过滤法 真菌和放线菌等丝状菌的野生型菌株在基本培养基中产生菌丝体，而营养缺陷型菌株以孢子形式存在，不能萌发。把诱变处理后的孢子悬液用液体基本培养基培养，适温振荡培养，使野生型孢子萌发形成菌丝体，用灭菌脱脂棉、滤纸等除去菌丝体，再培养，再过滤。重复3～4次，最大限度地除去野生型菌株，然后再分离 方法3：高温杀菌法 对产芽孢菌，先用完全培养基对诱变后的菌株培养到产生芽孢，再用基本培养基培养一定时间，野生型芽孢萌发成营养细胞，缺陷型芽孢不能萌发，这时用80℃处理一定时间，野生型营养细胞被杀灭，而缺陷型芽孢因为耐热而存活。 5. 1.3 营养缺陷型的检出方法1：点植对照法（见图7.12) 5. 1.3 营养缺陷型的检出方法2：影印法（见图7.13) 5. 1.3 营养缺陷型的检出方法3：夹层法（见图7.14) 5. 1.3 营养缺陷型的检出方法3：限量补充法 P178 在基本培养基中补充微量营养缺陷型菌株所不能合成的营养物质，野生型菌株生长快、菌落大，而营养缺陷型菌株生长慢、菌落小。 5. 1.4 营养缺陷型的鉴定 测定营养缺陷菌株所需营养因子的种类 5. 1.4.1 鉴定方法 方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基倒混 合平板或涂布平板，再在平板上点接各种营养物质（最好稀释成一定浓度，用滤纸片法接入），适温培养，观察生长圈。此法可以在一个平板上对一株菌进行多种营养因子进行测定 方法二：在基本培养基中加入某种营养物质，倒混合平板，再点接菌株，观察生长圈。此法可同时对多个菌株进行测定 5. 1.4.2 缺陷型鉴定步骤 营养因子类别测定→ 营养因子种类测定→复证试验 步骤1：缺陷型营养因子类别测定：用各类营养因子的代表物质的混合物： 氨基酸混合物、酪素水解物或代表氨基酸类 酵母浸汁，其中氨基酸、维生素、碱基都有 维生素混合物，代表维生素类 核酸碱基混合物，代表核苷酸类 步骤2：缺陷型营养因子种类测定 缺陷型营养因子类别确定后，再用该类营养因子的各种代表物质纯净物做试验，以确定其缺陷哪一种或几种营养因子。可以先把该类物质分成几组进行测定，逐步缩小范围，最后菌体测定到种类 (P180) 常用浓度：氨基酸1~10mg/mL;维生素类0.01~0.1mg/mL 氨基酸和维生素分组分别见P182表7.14和表7.15 5.2 营养缺陷型突变株的应用 工业微生物育种中，用于积累代谢中间产物 作为杂交、重组育