土壤中分解尿素的细菌的分离与计数公开课.ppt

专题2 :微生物的培养与应用 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 * 课题背景 1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌能利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2)2 脲酶 + H2O + CO2 2NH3 * 3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 研究思路 ㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照 * 1、实例： PCR技术 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。 DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 ㈠.筛选菌株 * 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等； 方法： ⑴抑制大多数微生物的生长 ⑵促进目的菌株的生长 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。 2、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 * 15.0g 琼脂 1.0g 尿素 10.0g 葡萄糖 0.2g MgSO4`7H2O 2.1g NaH2PO4 1.4g KH2PO4 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： ①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基 * ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖 氮源：尿素 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理 * 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基 * 5、怎样证明此培养基具有选择性呢？ 以尿素为 唯一氮源 的培养基 牛肉膏 蛋白胨 培养基 ?是 分离 尿素 细菌 判断该 培养基 有无选 择性 实验组 对照组 培养基类型 是否 接种 ?目的 ?结果 只生长尿素细菌 生长多种微生物 是 * 1、显微镜直接计数： 利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 ㈡.统计菌落数目： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 缺点： * 2.间接计数法（活菌计数法） ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 ⑵常用方法：稀释涂布平板法。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 * 说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。 * 注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 * 实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。 ⑴土样不同 ⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质) 小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 假设一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 假设二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 如何验证? * （三）设置对照 ①判断培养基中是否有杂菌污染： 将未接种的培养基同时进行培养。 ②判断选择培养基是否具有筛选作用： 完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。 主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果