GB/T 22917-2008猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 22917—2008 猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法 Protocol of fluorogenic RT-PCR for swine vesicular disease virus 2008-12-31 发布 2009-05-01 实施 发布 GB/T 22917—2008 -1.Z- —1— 刖 弓 本标准参考了世界动物卫生组织（（）IE） 《陆生动物诊断试验和疫苗手册 （哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》 （第5版）。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位 ：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、中华人民共和国云南出入境检验检 疫局c 本标准主要起草人:花群义、卢体康、吕建强、阮周曦、杨云庆、周晓黎、杨素、董俊、陈书琨。 T GB/T 22917—2008 猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。 本标准适用于动物及其产品中猪水泡病病毒的检测。 2缩略语 下列缩略语适用于本标准。 2. 1 荧光 RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 2. 2 Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值吋所经历的循环数。 2.3 RNA 核糖核酸。 2.4 DEPC 焦碳酸磷酯。 2.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水，配方见附录Ao 2. 6 Taq 酶 Tag DNA聚合酶。 2.7 SVDV 猪水泡病病毒。 3原理 根据猪水泡病病毒的基因特定序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 。引物 和探针通过严格的设计和筛选，涵盖已报道的所有猪水泡病病毒的毒株 。荧光探针的5端标记FAM 荧光素，3端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5 ’端报告荧光基团发出的荧光信号 。扩增吋， 由于八旳酶的5*3 ‘的外切活性，在延伸到荧光探针吋，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信 号产生 。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。 4材料与试剂 4.1仪器与器材 4. 1. 1荧光RT-PCR检测仪。 4. 1.2 高速台式冷冻离心机 （离心速度12 000 r/min以上）。 4. 1.3台式离心机或手掌式离心机（离心速度3 000 r/min） o 4.1.4混匀器。 4. 1.5 冰箱（2 °C〜8 °C和一20 °C两种）。 4. 1.6微量可调移液器 （5 mL,10 mL,100 mL,1 000 ML ）及配套带滤芯吸头。 4. 1.7 1.5 mL.O. 5mL硅化Eppendorf管:将Eppendorf管和滴头浸泡于含有0. 1% DEPC的三蒸水 中过夜，121 °C±2 C高压灭菌15 min,40 °C烘干备用 。市售Eppendorf管和滴头已经硅化，可直接 1 GB/T 22917—2008 使用。 4. 1.8 0. 2mL透明薄壁PCR管。 4. 1.9 6X