免疫组化技术课件..ppt

免疫荧光技术将 荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位 免疫荧光技术 １.异硫氰酸荧光素 FITC ２.四乙基罗达明 ３.四甲基异硫氰酸罗达明 ４.藻红蛋白 ▲ 呈现不同的荧光： 绿色荧光 (FITC) 橙色荧光 橙红色荧光 红色荧光等 荧光素 作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物 荧 光： 在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失 荧光显微镜： 荧光显微镜的光源提供各种激发光，如 紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围）， 使受检标本内的荧光物质发出发射光 海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触) 培养的成纤维细胞 微管呈绿色 核呈蓝色 免疫酶组织化学 酶标记抗体法 非标记抗体免疫酶法 多聚螯合物酶法 酶标记抗体法 是用结合物将酶标记（共价键或非共价键方法结合）在抗体分子上，通过抗原-抗体反应使抗原-抗体复合物上带有酶分子，再借助酶对底物的特异性催化作用，在抗原-抗体反应部位形成不溶性有色产物，在显微镜下观察组织中抗原的性质和分布。可用作标记抗体的酶有多种，但最常用的为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AKP）其方法可分直接法和间接法两种。 直接法 直接法是将酶（如HRP）直接标记在特异性抗体上，然后与组织中的相应抗原相结合，形成抗原-抗体-HRP复合物，最后进行显色。 ② 间接法 间接法也称夹心法，是将酶标记在第二抗体上（第二抗体为抗第一抗体的抗体），形成抗原-第一抗体-第二抗体-HRP复合物，然后进行显色。该法要求第二抗体与第一抗体应是不同种属的动物产物。间接法应用广泛，只需标记一种二抗就可以检测众多相同种属来源的一抗。 免疫组化SP法的基本步骤 （1）石蜡切片脱蜡至水。 （2）抗原修复 （3）3% H2O2室温孵育5~10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （4）蒸馏水冲洗，PBS洗。 （5）5%~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的第一抗体或即用型第一抗体，37℃孵育2h或4℃过夜。 （6）PBS冲洗，5min×3次。 （7）滴加适当比例稀释的二抗，37℃或室温孵育10~30min。 （8）PBS冲洗，5min×3次。 （9）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释）或辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30min。 （10）PBS冲洗，5min×3次。 （11）显色剂显色（DAB或AEC）。 （12）自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，苏木精复染，中性树胶封片。 2、非标记抗体免疫酶法 在酶标记抗体过程中可降低部分抗体和酶的活性，使得抗体的效价降低。另外，血清中的非特异性抗体也可被酶标记，引起非特异性背景。非标记抗体免疫酶法是先用酶（HRP或AKP）去免疫动物，使其产生抗酶抗体，再将该抗酶抗体与酶结合，形成五环的复合物，例如PAP（HRP）、APAAP（AKP）等复合物。该复合物由于没有一个抗体受到共价键标记，保留了免疫活性，因此敏感性大大提高。非标记抗体免疫酶常用的有酶桥法，辣根过氧化物酶抗辣根过氧化物酶复合物（peroxidase antiperoxidase complex method, PAP）法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）法。 3．多聚螯合物酶法 该法是以高分子葡聚糖多聚化合物或氨基酸为骨架与抗体结合，将抗体（一抗或二抗）与HRP结合在一起，形成葡聚糖+HRP+抗体的巨大复合物，然后通过酶的底物进行显色。该法简便、敏感性高。其方法包括EPOS法（enhanced polymer one-step staining）、EnVision法（又称为ELPS法 enhance labelled polymer system）、UIP法、Power Vision法。 EnVision