双波长法快速测定蛋白质含量.docVIP

苏州医学院学报 2000 ;20 (1)  39 朱华亭　刘继明　殷昌硕　张学光 (苏州医学院免疫学研究室 ,苏州 ,215007) 　　摘要　目的　为了建立一种快速而灵敏的蛋白质检测方法。方法　在考马斯亮兰法测定蛋白质含量时 ,通过 采用 590nm和 450nm双波长代替单波长检测 ,并以酶标检测仪取代紫外 -可见分光光度计作为检测仪。结果　 此种改进不但提高了考马斯亮兰法检测蛋白质的灵敏度 ( 0. 127μg/ ml)和检测范围 ( 0. 127～31. 25μg/ ml) ,而且使 大量标本的检测可在一次检测过程中完成。标准直线相关系数 r2 = 0. 9965 ,表明在检测限内 A595 / A450和蛋白质 浓度 C呈良好线形关系。结论　双波长法可作为一种快速、敏的蛋白质检测方法。 关键词　蛋白质 ;定量 ;双波长 ;考马斯亮兰 中图法分类　R392 - 33 Rapid Two - colorimetric Assay for Protein Quantities Zhu Huating , L iu Ji ming , Yin Changshuo , et al (Depart ment of Immunology Suzhou Medical College ,Suzhou ,215007) Abstract　Objective　To improve t he sensitivit y of t he Coomassie brilliant blue protein assay. Methods　The Coomassie brilliant blue assay is accomplished by measurement of absorbance at 590 and 450nm. To linear wit h protein concent ration by t he ratio of t he absorbance ,590 nm over 450 nm , toreader as t he detecting equipment . Results　This simple process increases t he accuracy and improves sions　This assay can be as sensitive and rapid a met hod for protein quantities. Key words　Protein quantit y ; two - colorimet ric ; Coomassie brilliant blue 　　考马斯亮兰蛋白质定量法 ,也被称为 Bradford本 ,能减少系统误差。本实验拟用双波长代替单波 测定法[ 1 ]。该方法具有易开展 ,快速和对蛋白质特长 ,并用酶标仪代替紫外 -可见分光光度计提高检 异性好 ,所以被广泛用于蛋白质的测定[ 2 ]。但该方测灵敏度。 法也有其局限性 ,首先其检测灵敏度较低 ,只能检测 mg级水平的蛋白质 ;其次 ,考马斯亮兰检测的线性 1　材料和方法 范围窄 ,在 2～ 10μg/ ml之间 [ 3 ]。鉴于其有上述缺 1. 1　试剂 :考马斯亮兰 G - 250和结晶牛血清白蛋 点 ,是否能通过方法上的改进 ,拓展考马斯亮兰法的白 (购自 Sigma)。其它所用试剂为分析纯 ,去离子 应用范围。在酸性条件下 ,考马斯亮兰染料呈红色 ,双蒸水作为溶剂。 [2 ] 亮兰染料和考马斯亮兰 -蛋白质结合物有不同的吸 50ml 95 %乙醇中 ,再加入 100ml的浓磷酸 ( 85 % 光系数。传统考马斯亮兰法利用考马斯亮兰 -蛋白 W/ V) ,最后加蒸馏水至 200ml ,此染料于 4℃避光 结合物最大吸收波长 595nm时的吸收度 A来反映可存放 6个月。临用前 1∶稀释。 蛋白质的浓度 ,而忽略了游离考马斯亮兰染料在此 1. 3　吸收光谱测定 :将染料 1∶稀释并过滤 ,在干 波长下也有一定的吸收度。在 EL ISA检测和 M T T净试管内加入 0. 8ml稀释好的染料 ,再加入 0. 2ml 测定中 ,常利用双波长法来消除杂吸收的影响从而的待测样本 ,对照品为蒸馏水 ,反应时间至少 5min , 提高检测的灵敏度[ 4 ]。酶标仪可一次检测大量标但不超过 30min。用紫外 -可见分光光度计 (上海 3国防科技预研项目 ( Y5573162)双波长法快速测定蛋白质含量 3but not t he absorbance of 590nm ,and replace t he UV/ V IS spect rophotometer wit h t he micro