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本文观看结束！！！ 5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响 2.2　干预前后细胞凋亡率的变化 流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48 h后，Eca9706细胞各处理组凋亡率分别为(13.76±0.47)%、(26.97±0.39)%、(41.03±0.19)%，与5-Aza-CdR诱导浓度成正比。与对照组[(1.39±0.27)%]比较差异有统计学意义(P0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P0.05，图1)。以上实验重复5次。 2.3　干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFPI-2 mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2 mRNA在未用药组细胞中未见表达。经1.6、25.6、102.4 μmol/L 5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2 mRNA表达，表明在一定范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2 mRNA表达逐渐增强(图2)。图1　各组流式细胞凋亡散点图A：对照组;B：1.6 μmol/L 5-Aza-CdR组;C：25.6 μmol/L 5-Aza-CdR组;D：102.4 μmol/L 5-Aza-CdR组。图2　5-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2 mRNA的表达　M：DNA marker;β-actin：301 bp;TFPI-2：440 bp;1：对照组;2：102.4μmol/L组;3：25.6 μmol/L组;4：1.6 μmol/L组;5：H2O对照组。,2.4　干预前后TFPI-2蛋白的表达情况　免疫组化结果显示，经5-Aza-CdR作用Eca9706细胞48 h， TFPI-2蛋白的阳性表达率增加，对照组、1.6 μmol/L组、25.6 μmol/L组、102.4 μmol/L组TFPI-2蛋白的阳性表达率分别为(2.10±1.42)%、(9.31±2.70)%、(14.72±3.50)%、(68.20±3.20)%，不同浓度组之间以及用药组与对照组之间的差异均有统计学意义(P0.05，图3)。　图3　各组TFPI-2蛋白的表达情况 3　讨　　论 人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22区域，全长由8164个碱基组成，其cDNA全长为1 222 kb。其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征，没有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的转录起始位点区域GC含量超过80%[1]。TFPI-2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤，TFPI-2的表达水平也会随之显著下降[2]。有研究证实，在绒毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中，与肿瘤产生相关的TFPI-2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关[1,3-5]。启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中的确切作用尚不清楚，然而众多证据表明，肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和转录抑制是肿瘤发生的重要机制之一[6-8]。 目前，有体外实验表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能[9]。本实验RT-PCR结果显示，TFPI-2在Eca9706细胞中无表达，经过不同浓度的5-Aza-CdR处理Eca9706细胞后，TFPI-2亦重新出现表达，且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强。MIZUNO等[10]研究表明，肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高4～12倍，也证实DNMT上调参与肿瘤发生。这与我们的实验结果一致。根据MTT实验可知，经过5-Aza-CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显。从本实验结果分析，DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖，并与其诱导剂量呈正相关，推测这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI-2基因的转录和表达有着直接关系;此外可能与去甲基化后诱导细胞凋亡有关。进而通过流式细胞仪分析，结果显示，经不同浓度5-Aza-CdR干预的Eca9706的细胞中，用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加，并且与5-Aza-CdR诱导剂量有依赖性关系。BENDER等[11]在同等条件下用5-Aza-CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时，发现肿瘤细胞增殖均被抑制，而纤维细胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR对Eca9706细胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响，可能是因为使TFPI-2重新表达的结果。 * 人民币汇率与商品进出口的关系 Presentation 2012 apr