第六章-基因在原核及真核体系中的表达.ppt

第六章 基因在原核及真核体系中的表达 第一节 真核基因在大肠杆菌中的表达 DNA? Protein 一、真核基因在大肠杆菌中的表达 1、理论上的困难: 遗传机制的差异 基因结构、 mRNA结构、转录信号（SD）、细菌蛋白酶、蛋白的后加工 cDNA、使用原核启动子及SD序列、引入突变体 二、原核生物的表达载体 1、Lac 启动子的表达载体 阻遏作用区、CAP作用区、RNA聚合酶作用区 2、Trp启动子的表达载体 trp启动子、操纵基因、前导序列 3、PL启动子的表达载体 CI的温敏突变（CI857)-阻遏蛋白在42? C 失活 三、高等真核基因在大肠杆菌中表达的实例 2、转译起始序列对表达效率的影响 转译起始的保守序列： AUG、SD(UAAGGAGGU的部分或全部）、核糖体的结合位点有一个或几个终止密码子、含全部或部分PuPuUUUPuPu 其他： SD后的4碱基4 A或4T（GC则25%-50%）、起始密码子左边UAU、CUU最好，UUC UCA AGG 下降20倍 3、启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响 4、质粒拷贝数对表达效率的影响 5、转录终止区对克隆基因表达效率的影响 终止区存在的必要性： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率 6 、质粒分离的不稳定性对效率的影响 质粒分配由par控制 克隆该基因 保持选择压力 反选择：质粒含CI， 宿主是溶源化细菌，其噬菌体启动子缺陷 7、密码子的使用频率(bias) 复习提纲 1、真核基因在大肠杆菌中的表达存在的问题及其解决办法。 2、真核克隆基因在大肠杆菌中表达的基本条件。 3、增强外源蛋白在大肠杆菌中表达稳定性的途径。 4、提高克隆基因在大肠杆菌中表达效率的途径。 第二节 哺乳动物基因工程 一、哺乳动物基因转移的遗传选择标记 嘌呤和嘧啶代谢 1、嘌呤和嘧啶的生物合成-全程途径和补救途径 2、胸腺激酶（thymidine kinase tk）基因选择系统 胸苷? 胸苷一磷酸 （1）tk-细胞 建立tk-细胞系方法：取代法 5-溴尿嘧啶脱氧核苷（BudR）TK+?胸腺嘧啶?掺入DNA链?致死 （2）HAT选择法 3、二氢叶酸还原酶基因选择系统（DHFR） 4、氯霉素乙酰转移酶基因选择系统 瞬间表达 CAT 5、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 XGPRT 6、氨基糖苷磷酸转移酶 APH 二、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法 1、磷酸钙转染技术 （1）基本步骤 DNA+CaCl2? CaCl2 -DNA? 滴加到Hepers-磷酸钙溶液? DNA-Ca3(PO4)2?转移沉淀到培养细胞层 添加剂：甘油 二甲基亚砜（DMSO） （2）影响磷酸钙转染效率的因素 DNA的量（高浓度 10~50? g/ml） 与细胞接触的保温时间 与添加剂作用时间 2、DEAE-葡聚糖转染技术（二乙胺基葡聚糖） Diethyl-aminoethyl-dextran 高分子阳离子试剂 （1）一般程序 DNA+DEAE-dextran ? 处理细胞 细胞+DEAE-dextran ? DNA （2）DEAE-dextran转染的可能机理及影响因素DEAE-dextran包围DNA? 免受核酸酶降解DEAE-dextran与细胞壁作用? DNA容易进入转染效率的影响因素：细胞量、DNA浓度、DEAE-dextran浓度对细胞有毒性? 低浓度、短时间 （3）DEAE-dextran转染法的评价 方法简单，重复性好，适于瞬间表达，效率比（1）高，但不能产生稳定的转化细胞系，使细胞形成微染色体3、聚阳离子-DMSO转染技术聚阳离子处理? 提高DNA对表面吸附DMSO? 提高细胞膜透性  4、基因显微注射技术 (micro-injection) 效率高 tk? 鼠 50%~100%转化率 500~1000细胞/hr 5、电穿孔DNA转移技术（electroporation) （1）基本原理 细胞膜? 高压临时性破裂，形成微孔? 进出细胞? 微孔关闭，0? C延迟 （2）操作程序 细胞+DNA? (0? C，2~4KV) ? 细胞转移新培养基? 筛选 存活细胞 60~80% 25~30转化子/105活细胞 （3）影响因素 最大电压、持续时间、细胞类型