PCR引物设计原理资料.pptVIP

PCR引物设计原理;PCR反应一般由三个步骤组成：① 模板的热变性；② 引物复性到单链模板上；③ 热稳定DNA聚合酶催化的延伸;;变性;复性温度（退火温度）至关重要！！！ 退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低； 退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增； 退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低 3-5 ℃下进行。 最好通过对复性温度比两条引物的Tm 值低 2-10 ℃内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。;对 Taq DNA 聚合酶来说，最适温度为72-78 ℃，时间约为1min。;引物设计要点;（3）重复或自身互补序列： 形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。;（4）上下引物的互补性： 一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。 当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3末端都不能和 其他任何引物互补。 ;（5）解链温度（Tm 值）： 计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差不能大于10 ℃；引物的 Tm 值一般为50-70℃。 这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR 循环可有效变性。;（6）3’末端 3’末端的性质非常关键。 如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A； 但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。 ;当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大降低； 当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般 PCR 反应中，引物3’末端的碱基最好选T、C、G，而不选A。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。？？ （7）5’端序列添加限制性酶切位点：;一些概念;正向引物 （forward primer）：处于DNA双链上游的引物。如用于测序，则从5’→3’方向读出 DNA正链的序列。 反向引物 （Reverse primer）：处于目的DNA双链下游的引物。如用于测序，则读出 DNA负链从下游到上游的反向序列。 ; ;Primer Premier 5.0 软件设计引物;正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented）及反向互补（reverse complemented ）。;正向（As is）;反向（reversed）;互补（complemented）;Enzyme;软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq 或 Map，分别以序列或图示的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存结果。;Motif;;Primer;点击 Search，进行引物有哪些信誉好的足球投注网站;Search criteria 窗口：多种参数可以调整。;Manual→Search parameters →人工有哪些信誉好的足球投注网站参数设置窗口。;Search progress 窗口中显示Search Completed→OK键;结果窗口→有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。;该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该引物的最佳退火温度！！第四层：四种重要指标的分析 ;引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为18-27 nt。 ;BLAST 验证引物;在Enter Query Sequence栏中输入引物序列： 例：引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’; 5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’ 同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5’ → 3’。输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物。;在Choose Search Set栏中：Database根据预操作基因的种属定了，可选Human genomic + transcript或Others;在Program Selection中：选择Somewhat similar sequences (blastn)项，如下图：;在General Parameters中：Expect thressho