实验二-免疫球蛋白的提取.ppt

实验二、免疫球蛋白的提纯 概 述 从血清中（或体液中）分离免疫球蛋白就是根据各类免疫球蛋白与其他血清蛋白的分子大小、电离密度、等电点及在水溶液中溶解度不同的特性，将他们分离出来，进而加以纯化。免疫球蛋白的分离与纯化是免疫学实验技术的基础。免疫球蛋白分离与纯化的方法很多，常用的有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法及亲和层析法等。 凝胶过滤法 凝胶过滤主要是利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶作介质，按照各物质分子量的不同、分子形状和水化作用的不同，在层析柱上进行分离。 一些小分子物质可以进入凝胶粒子内部，洗脱时速度较慢，大分子物质被阻于凝胶粒子外，洗脱较快。 常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、交联聚丙酰胺和琼脂糖凝胶等。 离子交换层析法 离子交换层析是利用蛋白质带电部分与具有相反电荷的离子交换剂的吸附和解吸附原理进行的。 常用的离子交换剂有DEAE纤维素（ ?球蛋白）和QAE-交联葡聚糖A-50（IgG），二者都是碱性阴离子交换剂，当溶液PH高于蛋白质等电点时，其阳离子基团可与蛋白质的阴离子基团交换吸附。当溶液PH接近蛋白质等电点时，蛋白质静电荷变为零，不能吸附，被洗脱下柱。 由于各种蛋白质带电量不同，与离子交换剂结合能力也不同，用一定PH的溶液洗脱即可将它们分开。 在碱性溶液中血清蛋白质的解吸附次序是：?球蛋白带电荷最少，首先洗脱；其次为?球蛋白和?球蛋白，最后为白蛋白。 亲和层析法 由于抗原和抗体可发生特异性的可逆结合，先将抗原或抗体等偶联到某种固相载体上装柱，再加入分离样品进行层析。样品中的特异性抗体或抗原被吸附，其它成分则从层析柱下端流出。再用洗脱剂将吸附在柱上的抗体或抗原解离洗脱下来，即可得到纯化的抗原或抗体。 盐析法 在蛋白质胶体溶液中加入中性盐可以使蛋白质分子从溶液中析出，这一过程称为盐析。中性盐离子大量进入蛋白质胶体溶液时，影响水分子与蛋白质分子极化部分的相互作用而减少其亲水性，并中和其电荷，最后使蛋白质分子聚集沉淀。 各种蛋白质聚集沉淀所需要的中性盐浓度不同，控制盐的浓度，能将血清中免疫球蛋白分离出来。 盐析法可用于粗提免疫球蛋白，去掉血清白蛋白等组分。也可用于浓缩免疫球蛋白。 + + + + + + + - - - - - - - 酸 酸 碱 碱 带正电荷的蛋白质 （悬浮） 在等电点的蛋白质 （悬浮） 带负电荷的蛋白质 （悬浮） 脱水作用 脱水作用 脱水作用 + + + + + + + - - - - - - 中和电荷 中和电荷 带正电荷的蛋白质 （悬浮） 带正电荷的蛋白质 （沉淀） 带负电荷的蛋白质 （悬浮） 用于盐析的中性盐一般是硫酸铵。因为其溶解度高且受温度影响小，一般不引起蛋白质的变性。 用33.3%的饱和硫酸铵提取免疫球蛋白时，可获得较纯的IgG，但会损失一部分?-球蛋白。 用50%的硫酸铵提取IgG时产量较高，但?-球蛋白也会同时沉淀。 如要将血清中各种免疫球蛋白都分离出来，可用50%的饱和硫酸铵。 硫酸铵盐析法提纯血清中的免疫球蛋白 材料 器材： 1、紫外分光光度计、磁力搅拌器、离心机； 2、三角瓶、吸管；3、透析袋 试剂： 1、饱和硫酸铵溶液；2、生理盐水； 3、血清 4. 1%BaCl2 5. 奈氏试剂 方法步骤 （1）盐析： 血清5ml用等量生理盐水稀释，逐滴加入饱和硫酸铵10 ml，边加边搅拌，加完后继续搅拌10min，室温10min或更长（4℃静置3h或过夜，充分沉淀）。 4000rpm离心15-30min，取沉淀用10 ml生理盐水溶解，搅拌下逐滴加入5 ml饱和硫酸铵，室温10min或更长（4℃静置3h或过夜，充分沉淀）。离心，取沉淀。重复沉淀三次可提高分离物纯度。 方法步骤 （2）脱盐：用透析法（或用凝胶过滤法） 用少量生理盐水将沉淀溶解，用毛细滴管将其移入透析袋中，两端扎紧，将透析袋浸没于大烧杯中，先对蒸馏水透析12小时，换液两次，再对生理盐水透析，换液三次以上，直至透析液中无NH+4（用奈氏试剂检验，无黄色出现），无硫酸根离子（1%氯化钡检验，无白色沉淀）。 方法步骤 （3）浓缩： 经透析的蛋白质溶液，如果浓度太稀，可在透析袋中用冷风（10 ℃以下）吹，或包埋于脱水剂（变色硅胶、聚乙二醇、蔗糖等）中浓缩。 方法步骤 （4）测定： 提取的蛋白溶液用生理盐水稀释后，用紫外分光光度计测定其280nm和260nm时的光密度。按下列公式计算蛋白质浓度。 Lowry-kalokar公式：蛋白浓度（mg/ml）=1.45*OD280-0.74*OD260 OD读数以1.0左右最为适宜，如OD2时就需要稀释，计算蛋白浓度时应乘上稀释倍数。