聚合酶末端脱氧核苷酰转移酶.ppt

Klenow酶 1）5’---3’聚合酶活性 2）3’---5’外切酶活性 作用： 1）修复限制性内切酶造成3凹端，成为平末端。 2）用同位素对DNA标记。 3）催化第二链合成 4）测定DNA序列 3．末端脱氧核苷酰转移酶(TdT) 图3-14 1） 适合于带有3’游离羟基的双链分子。 2) DNA双链3’端突出时， TdT将脱氧核苷酸聚合在二条链的3’端。 作用：TdT在人工粘性末端的构建极为有用。 4. SI核酸酶 1）降解单链DNA或RNA 2）反应方式为外切和内切 3）酶量大时降解双链核酸 作用：切平突出单链末端, 和发卡结构中环状。制作SI图谱 5．Bal31核酸酶 图3-15 1）3’端外切酶活性 2）5’端外切和内切活性。 作用： 1）从双链DNA两端连续降解 2）单链DNA外切和内切 3）超螺旋结构的线性化 4） 在分子克隆中可控制性截短DNA分子 * 工具酶与基因工程 一．限制性核酸内切酶 1．限制性核酸内切酶的发现 2．I类和III类限制和修饰酶的基本特征 3．II类限制和修饰酶的基本特征 4．甲基化酶的基本特征 二．其它工具酶 1． DNA连接酶 2．聚合酶 3．末端脱氧核苷酰转移酶(TdT) 4. SI核酸酶 5．Bal31核酸酶 6．碱性磷酸单脂酶 限制性内切酶 (Restriction Endonuclease)* 存在于任何一种原核细菌中.* 在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性片段.* 各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱.* 在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要.? 一．限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用) 宿主细胞的限制和修饰作用： 两种不同来源的入-噬菌体 入K；入B，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株 ，B 株 ）。 当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但 入K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入K 后代，能感染 B 株, 不能感染原来 K株. 1 宿主细胞的限制和修饰作用； 1．两种不同来源的入-噬菌体 （ 入- K ，入-B ）。 2．能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株 ，B 株 ）。 3．当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时， （ 入K-B ，入B-K ）感染下降数千倍。 4．一但 入K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株, 不能再感染原来 K株. 称为：宿主细胞的限制和修饰作用 二．限制和修饰作用的分子机制 1．大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修饰系统。 1）?它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS. 2）?hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点） 3）?hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。 4）? hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA 特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。------（修饰） 3．当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 ----------（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程 中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5．但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但 入-K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株, 不能感染原来 K株.) 6．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。C株不能产生限制性内切酶，其它