10基因功能的研究方法.ppt

尽量避免在反义RNA分子中出现自我互补的二级结构。 设计的反义RNA分子中不应有AUG或开放读框，否则该反义RNA亦会与核糖体结合而影响其与靶mRNA的配对结合。 进一步还可以将带有ribozyme结构的RNA连在反义RNA的3端尾上，当反义RNA与靶mRNA杂交后，即可利用其酶活性来降解靶mRNA。 此外，为了增强反义RNA的作用，还可以采取一些额外措施，例如： 由于反义RNA对靶mRNA的抑制作用有剂量依赖性，所以在构建反义RNA基因时，要选择强的、可以诱导的启动子以增强反义RNA本身的表达。 构建许多个反义RNA基因串连在一起，以得到线性重复的多拷贝基因，对提高反义RNA的表达也有利。 RNA酶Ⅲ可以降解RNA：RNA杂交体，所以在构建反义RNA基因时，可将RNA酶Ⅲ的基因也同时转化到靶细胞中并进行表达。这样，当反义RNA与靶mRNA结合后，RNA酶Ⅲ即可将其降解。这显然有利于反义RNA的抑制作用。 3．内含子归巢突变 什么是内含子归巢? 在I类II类的某些内含子中含有开放读框，可产生具有三种功能的蛋白。 这些蛋白可使内含子（或以其原来的DNA形式，或作为RNA的DNA拷贝）移动(mobile)，使内含子可插到一个新的靶位点，这个现象叫做归巢（homing）。 I组和II组内含子分布很广，在真核和原核细胞中都有发现。 在这些内含子的开放读框中编码具有三种功能的蛋白，这些蛋白与DNA或RNA的代谢有关。 核酸内切酶：在DNA的靶位点剪切，使内含子得以插入； 反转录酶：涉及将内含子RNA变成DNA拷贝； 成熟酶：从前体的RNA中切掉内含子的部分。 第I组内含子具有编码核酸内切酶的开放读框；有时成熟酶的活性和此蛋白有关。 第II类内含子具有编码核酸内切酶和反转录酶的序列，另外成熟酶的活性也与此蛋白有关。在有些情况下还具有与其它酶活性相关联的成熟酶功能的遗传信息，成熟酶主要功能是使内含子的构象稳定，这于剪接来说是很必要的。 现已知道有些第I组内含子编码核酸内切酶，它们的作用是帮助内含子在杂交中能插入到其不同等位基因的座位中。 在真菌的线粒体中普遍存在着内含子的多态性或者缺乏内含子，有种观点认为内含子来源于基因的插入。 通过分析酵母线粒体的大的rRNA基因在杂交中的重组，另一种观点认为以上的现象是基因的丢失。 在第I组内含子中含有编码序列。这些内含子存在于“ω+”的酵母品系中，但另一品系“ω-”中缺乏此内含子，将ω+和ω-进行杂交其后代通常都是ω+。 如果我们将ω+品系看作供体，将ω-品系前成受体，我们从ω+×ω-杂交中会发现ω-基因组中产生了内含子的新拷贝，结果使全部后代都表现为ω+。 在两个亲本任何一个都可发生突变而抑制以上的归巢。 突变的结果使杂交后代中出现了正常分离，即ω+和ω-的后代中出现了正常分离，即ω+和ω-的后代数相等。这种突变表明了这个过程的性质。 在ω+的品系中突变发生在紧靠着内含子将要插入的位点。在ω-品系中突变发生在内含子的开放读框中，从而阻止了蛋白质的合成。这表明在ω+品系中的内含子编码的蛋白识别ω-品系的靶位点，将其切开，并将内含子的一个新拷贝插入切开的靶位点中，使之变成ω+品系，而且能稳定地遗传。 这种蛋白的作用是什么呢？ω内含子的产物是一种核酸内切酶，它能识别ω-基因并将它作为靶点切开其双链。这种核酸内切酶识别18bp的靶序列，此含有内含子插入位点。靶序列的剪切是在每条链插入位点的3’端这一侧2个碱基处交错切，这样剪切位点占4个bp，产生了凸出的单链末端。 这种类型的剪切是和转座子移到新位点的机制有关。双链的断裂起始了基因的转变，在转变中ω+基因序列产生了一个新拷贝取代ω-基因，这个过程涉及通过复制机制进行转座，且仅在DNA水平上发生或以DNA取代的方式，或以模板转换的方式（与重组修复相类似）来完成。要注意内含子的插入中断了内切酶对这个序列的识别，这样使其稳定。 其它含有开放读框的第I类内含子也可以移动。内含子永久存在的机制是相同的：内含子编码的核酸内切酶剪切内含子将之插入特殊的靶位点。 插入的细节是有不同的。例如T4噬菌体td内含子所编码的核酸内切酶就是在靶位点上游24bp处剪切，然后内含子本身插入这个位点，而不是其新产生的拷贝。 虽然内含子移动的机制是共同的，但靶位点的序列和内含子编码区域之间并无同源性。据推测内含子有一个共同的进化区域，但很明显它们有很大的歧化。靶位点是在各种靶序列中最长的，对于核酸内切酶来说也是最特异的。结果内含子永久性地插入到单个的靶位点中，而且不插入基因组的任何其他地方，此就称为内含子归巢( intron homing)。 含有编码核酸内切酶序列的内含子在不同细菌和低等真核生物中都有所发现。由此产生一种游离的因子，其编码的功能涉及到RNA的剪接