分子生物学技术-课件.ppt

* 最初以M13噬菌体为载体，宿主菌是大肠杆菌。 蛋白质相互作用研究 　 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科———蛋白质组学应运而生。 蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。 对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一。 迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。 蛋白质相互作用研究当前进展 1.利用蛋白质片段互补研究其相互作用和文库筛选 2.通过核糖体展示进行相互作用的体外筛选和进化 3.利用膜上肽合成法分析蛋白相互作用 4.蛋白质成束法增强其相互作用的检测 5.用计算方法分析全基因组蛋白质的相互作用 6.通过蛋白质相互作用发展新的治疗方法 7.利用核磁共振法分析蛋白质相互作用 免疫共沉淀 荧光共振转移技术 噬菌体展示技术 酵母双杂交技术 基因外抑制子 合成致死筛选 分子生物学方法 亲和印迹 Pull down 试验 遗传学方法 蛋白质相互作用研究方法 生物物理学方法 蛋白质相互作用的实验技术 标签融合蛋白（Labeled fusion protein） 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation） 酵母双杂交（Yeast two hybrid system） 荧光共振能量转移技术（FRET） 表面等离子共振技术（Biacore SPR技术） 原子力显微镜技术（Atomic force microscopy） 噬菌体展示技术（Phage display） 融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。 为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ,GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST 与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面： 一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用 洗脱 （2） 结合 （3） 检测 （6） 收集 （5） 洗脱 （4） 固定诱 饵蛋白 （1） 噬菌体展示 噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。 其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。 噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。 噬菌体展示技术 Phage display techniques, PDT  　 大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd和M13,它们只感染含F因子的大肠杆菌。 1985年,美国Missouri大学Smith博士等人将R I核酸内切酶基因片段连接到丝状噬菌体fd编码次要外壳蛋白的基因Ⅲ中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。 后经验证,该噬菌体能被EcoRⅠ核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术的诞生。 噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。 1990年Scott等人利用噬菌体展示技术构建了随机多肽文库,该文库由特定长度的随机短肽组成,理论上包含了某一固定长度短肽所