DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍.doc

双脱氧链终止法又称为Sanger法 原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自 的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种 DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。 1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5h内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长3.5cM，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列 自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时 不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。 杂交测序技术 杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列 序检测速度快, 采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具 有部分第二代测序技术的特点。但 该方法误差较大, 且不能重复测定 焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是近年来发展起来的一种新的DNA序列分析技术，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核苷酸多态性(SNP)检测及等位基因频率测定等。 1 焦磷酸测序技术的原理及步骤 焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(1ueiferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物为5’-磷酰硫酸(APS）和荧光素。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。在每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，其高度与反应中掺人的核苷酸数目成正比。根据加入dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。在实验过程中用a-硫化的三磷酸腺苷(dATPotS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合酶利 用，而不被虫荧光素识别。由于SpdATPetS可以降低dATPotS降解产物的浓度，近年来，单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein，SSBP)和纯化Spisomer dATPaS的使用dATPotS降解产物抑制双磷酸酶活性的这一问题得到较好解决，使得测序长度可达100 bp，拓展了该技术在遗 罗氏454的GS FLX测序技术利用了焦磷酸测序原理，主要包括以下步骤： 1）文库准备 将基因组DNA打碎成300-800 bp长的片段 ( 若是sn RNA 或 PCR 产物可以直接进入下一步 ) ，在单链DN A的3’端和5’端分别连上不同的接