一种高特异性和灵敏性的HBVcccDNA检测方案研究-第三军医大学学报.doc

PAGE 3 一种高特异性和灵敏性的HBV cccDNA检测方案研究 陈 敏1，王永忠1，江培学2，张继明3 （213001江苏 常州，常州市第三人民医院肝病研究所1；200444上海，上海复星医学科技发展有限公司2；200233上海，复旦大学附属华山医院感染科3） [摘要] 目的 建立一种TaqMan探针的实时PCR检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）方案。方法 根据rcDNA与cccDNA结构差异，在缺口两侧设计引物，应用 TaqMan探针分析，加入1种可以去除rcDNA和部分扩增产物的依赖ATP的内切酶（Plasmid-Safe ATP-depe ndent DNase）。结果 通过高速离心获得病毒单质颗粒验证了该方案的特异性；通过克隆和酶切得到3.2kb的环状DNA验证了方案的灵敏性。结论 成功地建立了以TaqMan探针检测血清和肝组织HBVcccDNA的实时PCR检测方法。 [关键词] HBVcccDNA; 病毒单质颗粒；肝组织 [中图法分类号] [文献标志码] B [通信作者] 张继明，电话：（021E-mail：jmzhang@fudan.edu.cn 乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测是目前临床分析和判断患者病程和传染性的重要依据之一。共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV的原始复制模板，cccDNA的存在是病毒复制及感染得以维持的根源，抑制或清除cccDNA是治疗慢性乙型肝炎(CHB)的关键。实时定量PCR检测肝组织乙型肝炎病毒(hepatitis B [1-3]virus，HBV)、总DNA(total DNA，tDNA)和共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA) 成为评价抗病毒药物疗效的金指标，也是目前肝病基础和临床研究的一个热点[1-2]。 当前一些研究利用实时荧光PCR技术检测和定量病毒中的HBV DNA（松弛环状DNA，RC DNA）,这些研究大部分只是检测患者血液中的RC DNA,针对肝组织cccDNA研究很少[4-6]。因此在乙肝抗病毒治疗中，急需一种高特异性，高灵敏性，方便临床应用的能够真实检测HBVcccDNA的方案。 1 资料与方法 1.1 研究样本 在患者知情和医院伦理委员会核准下，收集16例2006-2010年常州第三人民医院传染科住院的慢性乙型肝炎患者血清和肝移植组织，诊断符合2000年9月“第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议”所修订的病毒性肝炎诊断标准[4]。包括E抗原阳性患者11例，其中男性患者8例，平均年龄42岁；女性患者3例，平均年龄36岁。所有样本-70℃保藏。 1.2 样本处理 所有肝组织样本和血清样本的DNA提取使用Qiamp DNA Mini Kit(QIAGEN GmbH,Germany)。肝组织样本重量不少于10mg，提取DNA前电子天平称重。 用Plasmid-Safe ATP-dependent DNase处理提取的DNA。 1.3 阳性对照 从未用抗病毒药物的慢性乙肝患者的血清中分离HBV DNA，然后构建HBV全基因质粒pUC-536207（GenBank登录号AY220698，B基因型）。以此作为阳性对照。 1.4 阴性对照 通过滤膜和超高速离心制备HBV病毒单质颗粒作为阴性对照。 1.5 Plasmid DNA校正品的制备 考虑扩增效率等因素，用于定量的校正品片段大小应该和cccDNA一致。取HBV全基因pUC-536207质粒，通过酶切然后连接制备成3.2kb环状DNA片段用以作为cccDNA定量校正品。 1.6 内参 GAPDH 基因作为人体内单拷贝数管家基因，它跟样本同时检测来估测每个PCR反应中的肝细胞数目。扩增曲线见图1。 图 1 内参基因GAPDH不同浓度扩增曲线 1.7 检测方法 扩增cccDNA的PCR引物序列是：HBV-1549, 5′-TCCCCGTCTGTGCCTTC-3′;HBV-1904, 5′-CCCCAAAGCCACCCAA-3′，在序列中的位置相应为1549～1565和1904～1889.荧光探针的位置是：5′-FAM-ATCTGCCGGACCGTGTGC-TAMARA-3′ (nt1567～nt1582)。具体位置见示意图2。PCR反应条件：（1）预变性94℃ 4min，（2）变性94℃ 15s，退火与延伸60℃，45s，共40个循环。血清HBV DNA和肝组织tDNA定量使用乙肝病毒定量检测试剂盒（复星诊断）。肝组织细胞数目通过内参GAPDH基因进行估