琼脂糖凝胶电泳.pdf

活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 琼脂糖凝胶电泳 本文主要介绍了琼脂糖凝胶电泳的原理及实验操作步骤 ，及电泳后 DNA 的回收方法 ；琼脂糖凝胶的特点及电泳实 验相关试剂的配置及琼脂糖凝胶电泳常见问题分析。 琼脂糖凝胶电泳样品制备 大肠杆菌质粒 DNA 模板提取 ： 1、接 1%含质粒的大肠杆菌细胞于 2ml LB培养基 2、37℃振荡培养过夜 3、取 100ul菌体于 2mlEp管中 ，4000rpm离心 3min ，弃上清 4、加 100ul溶液 A （1％葡萄糖 50mM/L EDTA pH8.0 ，25mM/L Tris-HCl pH8.0 ）充分混合 5、加入 200ul溶液 B （0.2 mM/L NaOH ，1％ SDS ），轻轻翻转混匀 ，置于冰浴 5 min 6、加入 150ul预冷溶液 C （5 mol/L KAc ，pH4.8 ），轻轻翻转混匀 ，置于冰浴 5 min 7、10000rpm离心 20min ，取上清 8、加入等体积的异戊醇 ，混匀后于 60℃静置 10min 9、再次 10000rpm离心 20min ，弃上清 10、用 500ul70％的乙醇洗涤 ，抽干所有液体 11、待沉淀干燥 ，溶于 5ul的TE缓冲液中 （通常可获得 3-5ug 的 DNA ） 真核细胞 DNA 模板提取 ： 真核细胞 DNA 的提取是进行功能和结构研究的重要一步 ，真核 DNA 提取要保证 DNA 的完整性 （不断裂 ）。真核 DNA 可以从培养的细胞新鲜的组织中提取。通常都是采用蛋白酶消化后用酚抽提获得。不同来源的材料进行不同 的预处理 ，但是后续提取 DNA 的方法是类似的 ，提取的原则就是 ，尽量减少对 DNA 的破坏或降解 ，保持其完整 性。具体提取步骤如下 ： （一 ）材料预处理 ： 培养细胞用缓冲液洗涤后离心 （4000rpm/5min ）去除上清 ，得到细胞沉淀物加入 10倍体积的裂解缓冲液 ，55℃ 水浴 1-2小时 ； Tel 025 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB ： （ ） 活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 组织 （组织要剪碎匀浆 ）加入 1.5ml到离心管中 ，加入 20%的 SDS 25ul ，蛋白酶 K （2mg/ml ）25ul ，然后混匀 ， 60℃水浴 1-3小时 ； （二 ）DNA 的提取 （适用于处理后的细胞或组织 ） 1. 预处理的样品加入饱和酚 ，轻轻混匀几分钟后离心 （5000rpm/10min ），去上层水相 ； 2. 加入等体积的饱和酚 ，混匀 ，再次离心 ，去上层水相 ；直至去上层水相变得澄清 ，不然可重复此操作 ； 3. 加入十分之一的 3M错酸钠 （pH2.5 ）HE 2.5倍体积的无水乙醇 ，轻轻混匀 ； 4. 出现絮状物后离心 （5000rpm/10min ），弃上清 ；用 75%乙醇洗涤沉淀 ，再次离心 ，弃上清 ； 5. 室温下晾干 （待乙醇挥发 ），加入 100ul TE溶解即可。 提取 DNA 的物品需要高压灭菌 ，以防止带入其他核酸污染 ；试剂同样高压灭菌 ； PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳原理 琼脂糖凝胶电泳 ，是以琼脂糖为介质 ，对不同大小的 DNA 或 RNA 实现分离的一 种电泳方法。琼脂糖是一种多糖 ，具有亲水性 ，但是不带电荷。使得 DNA 在碱 性条件下使其带负电荷 （pH8.0 的缓冲液 ），在电流作用下 ，以琼脂糖凝胶为介 质 ，由负极向正极移动 ，根据不同的 DNA 分子片段的大小和形状不同 ，在电场 中泳动的速率也不相同 ，同时在样品中加入染料 （如 EB或花青素类染料 ）能够 图 1琼脂糖凝胶电泳原理 和 DNA 分子间形成络合物 ，经过紫外照射 ，可以看到 DNA 的