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细胞活性测定 细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H 放射性同位素 掺入法、MTT 法等。其中MTT 法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射 性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT 法形成的 Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能 带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又 开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT 、CCK-8 （WST-8 ）等。 现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍： 1、MTT 法 MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻 唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不 溶性的蓝紫色结晶甲 （Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲 基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲 ，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定 其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的 量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的 抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度 高、经济。 缺点：由于 MTT 经还原所产生的甲 产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这 不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲 的有机溶 剂对实验者也有损害。 2、XTT 法 XTT ：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水 溶性的橙黄色甲 产物。当XTT 与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所 产生的水溶性的甲 产物的吸光度与活细胞的数量成正比。 优点： 1、使用方便，省去了洗涤细胞； 2、检测快速； 3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度； 4 、重复性优于MTT。 缺点：XTT 水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。 3、CCK-8 法或称WST-8 法 CCK- 8 试剂中含有WST–8：化学名：2-(2- 甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯 基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H- 四唑单钠盐]，它在电子载体1- 甲氧基-5- 甲基吩嗪 硫酸 二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度 水溶性的黄色甲 产物（Formazan）。生成的甲 物的数量与活细胞的数量成正 比。用酶联免疫检测仪在450nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数 量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛 选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。 优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、 检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4 、重复性优于MTT；5、 对细胞毒性小；6、为1 瓶溶液，毋需预制，即开即用。 缺点:1、与MTT 相比，CCK-8 和XTT 的价格比较贵。2、CCK-8 试剂的颜色为 淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。 XTT 比色法 【基本原理】 XTT 比色法有Scudiero 等首次采用，用于检测细胞增殖。XTT 是异种与MTT 类似的四唑氮 衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物，当XTT 与电子偶合剂共同 使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。 【试剂及材料】 （1） XTT ：用60℃预热培养液配制成6.6mmol/L，过滤除菌，现配现用。 （2 ） 吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）：用PBS 配制成220mmol/L，4 ℃避光保存20 天。 （3 ） XTT/PMS ：XTT 与PMS 按1：1 混合（临用时混合）。 【操作方法】 （1） 刺激增殖反应同前； （2 ） 于终止培养前2h，每孔加入XTT/PMS 20μ l，混匀后再培养2h； （3 ） 在酶标仪上450nm 处测定光吸光度，参考波长为655nm； 【结果分析】 计算SI ：SI ＝试验孔OD 均值/对照孔OD 均值 【注意事项】 （1） 丝裂原的质量和活性是测定淋巴细胞增殖反应的关键因素。不同厂家的产品，质 量、活性不同，其使用的