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江生物科技职业学院教案（第 页） 课题 综合实训二 制备谷光甘肽 教学要点与目标 目标：1.了解树脂柱纯化法制备谷光甘肽的基本原理； 2.熟悉树脂柱具体应用技术； 3．掌握多肽类生化物质提取纯化的基本操作技术。 教具与 材料 自编《生物分离技术实训指导书》 教学内容与设计： 组织教学 ：点名，检查学生的出勤人数 1 min 实验导入：理论上多肽类生化物质提取纯化应用哪些技术？ 2 min 综合实训二 制备谷光甘肽（6学时） 一、目的要求 1.了解树脂柱纯化法制备谷光甘肽的基本原理； 2.熟悉树脂柱具体应用技术； 3．掌握多肽类生化物质提取纯化的基本操作技术。 二、实验原理 谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽。自然界中谷胱甘肽主要存在于酵母、谷物种子胚芽，人体和动物的心脏、肝脏、肾、肌肉、血液的红细胞和眼球中。动物组织中含量较高，而植物组织中的含量较低。正常人体内还原性谷胱甘肽（GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSHG）的比例为100：1，还原性谷胱甘肽（GSH），分子小，是机体内重要的活性物质，它具有清除自由基、减毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。在医学上、食品行业及运动保健上具有广泛的应用。 制备谷胱甘肽（GSH）的方法，国内主要为酵母菌生物合成，每克酵母菌干细胞含GSH 18mg。所采用的分离提纯GSH的方法主要有两种，铜盐法和离子交换树脂法。本次实训采用市售或经发酵法制得的干酵母为原料，经加热 板书 讲解 黑龙江生物科技职业学院教案（第 页） 教学内容与设： 提取，离心除杂质，阳离子树脂交换、有机溶剂沉析等分离纯化得GSH湿品，经真空干燥后即得GSH成品。 三、材料用具 （一）材料 干酵母 100g 市售732阳离子交换树脂（60～80目） （二）试剂 5mol／L 30mL 、1mol／L 3000mL的硫酸溶液，2mol／L、1mol／L盐酸溶液、 丙酮 、硅藻土、2mol／L氢氧化钠、2％偏磷酸溶液、5％碘化钾溶液、淀粉指示剂、0.001 mol／L的碘酸钾溶液。 （三）器具 低温冰柜、冷冻离心机、不锈钢锅、搪瓷桶、冷冻干燥机、温度计、酸度计、层析柱、布氏漏斗、电瓷炉。 树脂柱纯化法制备谷光甘肽的操作流程 树脂柱纯化法制备谷光甘肽的操作流程 树脂柱纯化 GSH沉析 GSH的干燥 加热提取 GSH粗提 （一）流程 见图 分组准备 分组进行 黑龙江生物科技职业学院教案（第 页） 教学内容与设计： （二）操作 1.提取 将干酵母置于不锈钢锅中，在搅拌的条件下加入3倍体积的蒸馏水，再加入6倍体积沸腾的蒸馏水，升温至90～100℃，保持10 min，然后速冷至2～10 2.粗提液 用5mol／L硫酸调节pH值至2.8～3.0，冷冻离心（3000 r／min, 5～10℃ 3.粗提液层析 抽提液上732阳离子交换树脂柱（装置如图-3），流速6 mL／min，然后用1 mol／L硫酸洗脱，洗脱流速2 mL／min,25 min左右开始收集5mL流出液,进行快速含量测定,当流出液滴定值超过0.2 mL／mL时，开始收集，滴定值低于0.2 mL／mL时停止洗脱。 （1）732阳离子交换树脂装柱 将市售732阳离子交换树脂磨碎，筛选出60～80目。物理方法处理后，先以4倍树脂体积的2mol／L盐酸搅拌浸泡2h，反复用水洗至近中性后，再用4倍体积的2mol／L氢氧化钠溶液搅拌浸泡2h，反复用水洗至近中性后，再用4倍树脂体积的2mol／L盐酸搅拌浸泡2h，最后水洗至中性。按要求装柱后用1 mol／L硫酸平衡备用。 （2）GSH含量快速测定（碘量法） = 1 \* GB3 ①取5 mL待测样品，置于250 mL锥形瓶内，加入5 mL 2％偏磷酸溶液，1 mL 5％碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂，用0.001 mol／L的碘酸钾溶液滴定至溶液由无色变为蓝色止。 = 2 \* GB3 ②计算滴定值（碘酸钾溶液／待测样品，mL／mL） 4.沉析 将洗脱液倾入搪瓷桶中，在搅拌的条件下加入溶液体积10倍的冷丙酮（2～8℃ 5.干燥 将沉淀置于真空干燥器中干燥，即得成品。 五、注意事项 1.用硫酸调节pH值时，应用酸度计边测边调。保证其准确性。 2.离子交换树脂柱层析时应根据滴定值来确定收集洗脱液的间隔时间，随着 洗脱时间的增加，收集洗脱液的间隔时间应逐渐缩短。 六、思考题 1. 绘制出GSH标准曲线能否快速确定滴定值的大小？如何绘制出GSH标准曲线? 2.提取时为何加热后又要速冷 黑龙江生物科技职业学院教案（第 页）案 教学 课后作业与练习： 实训总结 课后记：