凉血化瘀方拮抗内质网应激引起L02肝细胞凋亡作用和机制探究.docx

凉血化瘀方拮抗内质网应激引起L02肝细胞 凋亡作用和机制探究 ［摘要］内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)启动的细胞凋亡是近年才发现的一种新的凋 亡途径，本研究从ERS途径探讨凉血化瘀方对肿瘤坏死因子 a (TNF- a )和D-氨基半乳糖(D-GalN)所致肝细胞凋亡 的保护作用。研究发现，TNF-a和D-GalN可明显抑制L02 肝细胞增殖，诱导细胞凋亡，使细胞质内游离钙离子含量明 显上升，并使ERS凋亡相关信号分子磷酸化PERK,磷酸化 elF2a , cleaved Caspase-12, GRP78, CHOP 的蛋白表达显 著增加。不同浓度的凉血化瘀方作用后，与TNF- a /GalN损 伤组相比，可显著减轻L02肝细胞的增殖抑制、减少细胞的 凋亡，抑制细胞质内游离钙离子含量的增高，并使磷酸化 PERK,磷酸化 elF2a , cleaved Caspase-12, GRP78, CHOP 的蛋白表达量呈逐渐下降的趋势。这些发现说明：凉血化瘀 方对TNF-a和D-GalN所诱导的肝细胞凋亡具有抑制作用， 其机制可能与维持内质网腔钙稳态平衡和下调ERS凋亡相关 信号分子磷酸化PERK,磷酸化elF2 a , cleaved Caspase-12, GRP78, CHOP的表达有关。 ［关键词］凉血化瘀方；肝细胞凋亡；内质网应激 凉血化瘀方是在叶天士温病“凉血散血”基本治法的 基础上，结合多年临床治疗经验和重型肝炎瘀热相搏的病理 特点而确立的方药，具有清热养阴、凉血化瘀、泻火解毒的 作用［1-2］,方药通过正交设计优选最终由生地黄、制大黄、 赤芍组成。前期研究结果显示凉血化瘀方对重型肝炎和实验 性肝衰竭确有较好的防治作用，对肝细胞凋亡有明显的干预 作用，初步探明了凉血化瘀法防治肝衰竭的作用机制是通过 抗肝细胞凋亡保护肝细胞、减轻肝损伤而发挥良好的治疗作 用［3-5］ o过度的内质网应激(ERS)可启动细胞凋亡，这一 条信号转导通路被认为是除死亡受体活化和线粒体损伤外 又一条新的介导细胞凋亡信号传导的通路［6］。本实验拟在 前期研究的基础上，利用肿瘤坏死因子a (TNF-a )和D- 氨基半乳糖(D-GalN)所诱导的肝细胞凋亡模型，观察凉 血化瘀方对内质网腔钙离子含量的调控，以及对ERS凋亡相 关信号分子磷酸化PERK ,磷酸化elF2a , cleaved Caspase-12, GRP78, CHOP蛋白表达的影响，以期进一步揭 示该方抗肝细胞凋亡的机制。 1材料 1细胞株 人正常肝细胞株L02购自中国科学院上海 生命科学研究院细胞库。 1.2药材凉血化瘀方药物组成：赤芍、生地黄、制大 黄。饮片在安徽省医药公司购买，由南京中医药大学中药鉴 定教研室鉴定，按照2005年版《中国药典》一部各中药项 下要求，进行相关质量分析包括主要成分含量测定，确保所 用饮片质量符合药典的规定。称取赤芍300 g.生地黄200 g、 制大黄200 g置不锈钢锅中加水3 000 mL浸润1 h,然后置 电炉上加热煎煮3次，煎煮时间分别为1 h, 40 min, 40 min, 过滤合并滤液，浓缩，制成含生药量1 g ? inL-l的母液，离 心取上清，0. 22 Um微孔滤膜过滤除菌，然后用无血清的培 养液稀释成高、中、低剂量分别为1, 0. 1, 0.01 g?L-1备 用（前期细胞毒性试验结果显示，当凉血化瘀方质量浓度高 于1 g - L-1时，L02细胞活性显著下降，而在0. 1?1 g ? L-1 时对细胞活力无明显影响）。 1.3试剂DMEM高糖培养基、胎牛血清、培养基瓶、细 胞培养瓶、6孔板、96孔板、胰蛋白酶、DMS0等均购自Gibco 公司；D-氨基半乳糖（D-GalN）, Fura-2购自Sigma公司； 人重组 TNF- a 购于 Cytolab/PeprotechAsia 公司；CCK-8 细胞增殖与毒性检测试剂盒购于上海碧云天公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自Invitrogen公司；cleaved Caspase-12, GRP78, CHOP, 3-actin 一抗和相应二抗均购 自 Santa Cruz 公司；phospho-PERK, PERK, phospho-eIF2 a , eIF2a 一抗和相应二抗购自CST公司；ECL发光试剂购自 Pierce 公司。 1. 4仪器电子天平（BP221S, Sartorius）.倒置显微 镜（重庆光学仪器厂）、恒温孵育箱（3111型，Thermo）、超 低温高速离心机(3K-15, Sigma).荧光显微镜(TE 2000-S, Nikon)、酶标仪(MK3, Thermo)、高内涵细胞分析系统(Th