生物催化简介-生物探索.ppt

酶的高通量筛选与定向筛选 报告人：黄剑宇 导 师: 张 卫 生物催化简介 生物催化与转化是以细胞或酶作为催化剂进行物质转化，大规模生产化学品、医药、能源、材料的科学。 优点：一个生物催化剂可以催化一系列底物甚至很多非天然底物；酶具有高度的选择性尤其在立体和区域选择方面具有化学催化剂无法比拟的优越性；生物催化反应通常反应条件温和具有环境友好性。 缺点：生物催化剂在目的介质中的不稳定性导致的活性降低甚至完全丢失；虽然生物催化剂可以催化我们所知的各种反应，但对于特定的底物和产物可选择的酶通常是很少的，而且目前只有极少数的酶可以商业获得；从酶的发现到生产应用通常是一个艰苦的漫长的过程。 实际应用取决于它与传统工业过程的竞争，只有在竞争获得明显的经济优势才能得到生产应用 生物催化研究过程 酶的筛选 酶的筛选可分为选择培养基筛选法和检测培养基筛选法。 选择培养基筛选法 通过添加或减少某种成分使目的菌株获得生长优势，而其它菌株的生长受到抑制，通过多次的筛选分离最终得到目的菌株。 单一碳源的选择性培养基，使能够利用反应底物的微生物获得生长优势而大量增殖，无法利用反应底物的微生物由于无法获得营养生长受到抑制，从而得到所需的目的菌株。 互补的方法，即在有营养缺陷的培养基上筛选能合成该种营养物质的菌株。 检测培养基筛选法 通常是在培养基中加入某种试剂或化学药物，使培养后发生某种可以辨别的变化，如培养基的透明度的变化或菌落周围颜色的变化，由此区别不同类型或生理特性不同的微生物。这种筛选可以在检测平板中进行，也可以在微孔滴定板中进行，借助一些检测仪器很容易实现高通量筛选。 酶的高通量筛选基于比色法和荧光检测的高通量筛选 基于检测培养基筛选法的，生色基团或荧光基团的底物参加的催化反应是最容易实现高通量筛选的。 通过监测反应过程中的颜色和荧光的变化可以有效地监测反应的进行。 使用比色计或荧光计检测显色或荧光底物，pH指示剂显色反应和荧光共振能量转移还可以实现高通量实时检测。 基于比色法和荧光检测的高通量筛选显色或荧光底物的高通量筛选 大部分荧光和显色底物都带高酸度的苯酚或苯胺离去基团，当前广泛应用的是以硝基苯和伞形酮衍生物作为底物的检测方法。 基于这种技术的检测方法简单快捷，结果准确容易实现数字化，可以做到实时监控，得到了广泛的应用。 但这类底物通常不够稳定，反应特异性差，反应速度快，比普通底物高出几个数量级，不适用于一些难转化的和难合成的反应以及粗酶催化的反应和一些条件剧烈的反应，如高温，高的pH值等。 基于比色法和荧光检测的高通量筛选 pH指示剂显色高通量筛选 许多水解反应伴随pH的变化，根据反应介质和反应平衡常数选择合适的pH指示剂可以准确的检测水解反应速率。pH指示剂显色技术被广泛地用于腈水解酶和酯水解酶等水解酶的筛选 Quick E法通过pH指示剂的显色反应监测互为对映体底物的水解速率，根据水解速率的差异来评价酶的立体选择性。这一技术最近被用于荧光假单胞菌酯酶定向进化中突变体的筛选，得到了立体选择性明显提高的突变体 Quick E 示意图 基于比色法和荧光检测的高通量筛选荧光共振能量转移底物的高通量筛选 荧光共振能量传递底物，不仅有非常好的静态定位能力，也能提供分子内或分子间两个荧光基团在距离和方向上的动态变化。 将这种方法扩展，可用于研究生物多聚体的组成动力学、DNA限制性内切酶酶切反应，以及DNA发夹结构的去折叠等。这种技术最近被用来检测核糖核酸酶反应活性。 基于反应热力学变化红外检测的高通量筛选 所有的物质都可以发射红外线，光电平面聚焦阵列红外检测器可以灵敏地检测反应过程中的热量变化（检测波长范围3-5μm ，温度变化10-100mK）。放热反应在红外成像中表现为“热”点，相反吸热反应表现“冷”点，通过对“热”点或“冷”点的分辨，可以检测反应的进行与否。 借助复杂的仪器设备的高通量筛选 高效液相色谱, 质谱和毛细管电泳也被用来检测反应速度，但是作为一种高通量筛选技术，这些方法测试成本较高，而且每天每台仪器最高只能检测几百个样品，方法的使用受到一定的限制。 采用放射性同位素标记底物进行脂酶的筛选取得了较好的实验结果，这种方法灵敏而且准确，但由于放射性其使用会受到限制无法推广使用。 酶的筛选（小结） 比色和荧光检测为代表的高通量筛选方法得到了广泛的应用，是当前酶的高通量筛选的主要研究和发展方向。 随着生物催化在精细化工和医药行业的广泛应用，对手性纯化合物的大量需求使手性酶的筛选成了当前的研究热点，同时产品价值的提高也将使得很多借助复杂仪器设备的高成本的检测方法成为可能并将逐渐得到更多的应用。 酶分子的定向进化 通过以上方法从自然界筛选到的酶