疑难血型问题分析与血型研究新进展.ppt

一 疑难血型问题分析 试剂红细胞上的抗原是纯合子，有较高的剂量效应，如JK（a+b-）、Fy（a+b-）；但病人红细胞上的抗原是Jk(a+b+)。出现阴性结果。 病人红细胞上没有表达相应的抗原，这类抗原通常是中度频率的稀有血型抗原，如K、Lua、Coa、Ytb，但试剂红细胞存在。出现阳性结果。 Langereis血型抗原系统： ABCB6由ABCB6基因编码，Lan是MDR/TAP亚家族成员。Lan（+）高频（日本除外），抗Lan极少。Lan(-)均为缺失纯合子，Lan(+)为杂合子或未缺失。位于染色体2q36，19个外显子组成，长约9kb。约35种突变造成。 ABCB6蛋白与血细胞携氧、肝脏解毒和细胞产能有关。现在认为其主要作用是通过转运保护有机体被毒物的损害，同时与多种药物/抗癌药物耐药性及抗原递呈有关。能够将卟啉运转到线粒体内部，卟啉是血红素合成所必须的。 ABCB6↑ 卟啉 ↑ →皮肤型血卟啉病：光暴露区皮肤脆性增加、水疱； →急性卟啉病：胸、腹、背和四肢疼痛，麻痹、抽筋甚至智力错乱。 存在于红细胞、线粒体外膜、及肝癌细胞膜。 Vel血型抗原系统 1952年病人Mrs.Vel的血液由于输血反应，其血液可以凝集许多人的血液，随后其抗体被命名为抗Vel。 1975年确定为常染色体隐性遗传。 2013年发现转膜蛋白SMIM1带有Vel的表位。确认 SMIM1的基因有17个核苷酸的缺失。 SMIM1是一个小基因，有4个外显子，编码区域在外显子3~4。在染色体的 1p36.32 ，与RHD、RHCE 位点为邻。 斑马鱼的SMIM1基因敲除研究发现有中等程度的RBC数量的减少， SMIM1转录水平的下降影响平均Hb浓度，证明是一种新的RBC形成调节因子。Jill R Storry等证实SMIM1是基因，Vel是血型。 Vel在世界范围内的阴性频率为0.04%，英国1/4000，瑞典北部略高，中国未知。 存在于成红细胞样的细胞系中。 3个血型的相应抗体均导致输血反应和HDN。未发现由于表型的缺乏影响生命活动。 班马鱼Smim1（转膜蛋白）基因敲除，整体原位杂交技术。生长3天的 仔鱼染色观察Hb,表明成熟的原始RBC中等程度的减少。Ana Cvejic等 胚胎期的基因敲除 同源杂交植入 胚胎 固化 整体原位杂交 染色 观察 定位 定性 定量 Vel x-射线衍射分析技术 分子时代的血型分析 PCR-SSP 基因测序 杂交 扩增测序 克隆测序 直接测序 原位杂交 分子杂交 最为常用的两种方法 血型基因分型的应用 近期输血的病人； 新生儿溶血病； 直抗阳性的病人细胞； 为分析AIHA病人潜在的同种抗体，AIHA的细胞往往DAT(+)； 弱的红细胞抗原； 输血反应； 大规模筛查抗原阴性的供者； 抗体缺乏时； A、B、D等血型不一致时； RhD的表型与基因关系。 最为简单，检测已知的位点； 根据目的要求，设计扩增引物，凝胶成像； 单位点/多血型； Mark的作用，是标尺； PCR-SSP 测序分析 1.目的基因的获取 ⑴ 引物的设计：⑵ 制备DNA：⑶扩增目的基因 2.目的基因纯化的方法 去除引物、dNTP、盐、非特性PCR产物 ⑴胶回收法；⑵柱法；⑶酶法：直接在PCR管中 进行，37℃15’ 酶消化，再80℃15’灭活酶的活性 3.测序样品的制备 目的基因测序前扩增，目的是结合上荧光染料 ① 样品不纯化：用于直接测序；② 测序样品纯化： 去除未结合的荧光标记的ddNTP等物质 4.纯化的方法： ⑴BigDye? XTerminator?法：无需转移测序产物； ⑵Centri-Sep柱纯化法：l测序产物转移至凝胶顶端； ⑶酒精-EDTA-醋酸钠沉淀法： 5.测序----毛细管电泳 ①将纯化后待测基因加入孔板；每孔10ul，将 孔板置入测序仪中； ②按操作说明书进行操作 Exon6 261一条等位基因出现碱基G缺失 297A ＞ G 626G＞A 467C＞T 297A ＞ G 261delG Exon7 1955年胰岛素全序列测定（色谱和标记技术）； 1960年RNA酶测定； 每个染色体的长度约为5500万-2.5亿bp，目前的一次测序约500-600bp，故需通过基因克隆和PCR将需要的目的片段取出，进行