基于纳米颗粒增强及酶循环放大的表面等离子共振生物传感器的研究答辩人-研究方向-导师-.ppt

2.2表面等离子共振生物传感器的优势 表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)生物传感技术是基于引起折射率变化的生物检测技术，这种微小的折射率变化与芯片上修饰的探针分子与靶物质的特异性结合成正向关联。与传统的生化分析方法相比，SPR的关键优势在于靶物质可以直接实时检测而不需要标记，同时具有灵敏度高、稳定快速、便捷实时，能够实现在线实时连续检测等适合生化分析的优点，其检测灵敏度较高，可以用于浓度介于皮摩尔到飞摩尔水平范围的微量物质检测。 2.3表面等离子共振生物传感器的应用 表面等离子共振生物传感器在薄膜光学、蛋白质组学以及检测分析分子之间的反应动态等领域均有较广泛成熟的应用，可以通过实时监测SPR共振角，进而对生物分子动态结合进行求证，同时也可以推断出被分析物的浓度、亲和力、反应动力学常数和特异性等信息[18]。商品化表面等离子共振仪已经发展成熟，并涉及到人类健康及生活水平的提高的多个领域均有广泛的应用[19-21]。 4.1生物素-亲合素系统(biotin-avidin system，BAS) 生物素-亲合素系统(biotin-avidin system，BAS)是一种新型生物反应放大系统。具有高度亲和力及多级放大效应，特异性强，分子量大，亲和力强，稳定性好，这些性质使亲和素-生物素体系在SPR在线检测中得到较好的应用。 4.2滚环复制放大 滚环复制放大技术（RCA) 是一种基于DNA或RNA引物沿环状DNA等温滚动复制来实现核酸扩增的技术，这种技术具有相对无限单链扩增，不需要对模板进行特殊的变性，快速、特异、灵敏等优点，近年来，被广泛应用于基因检测、临床诊断方面的研究中。 3.结果与讨论基底修饰位置的优化 3.结果与讨论基底修饰位置的优化 3.结果与讨论进样流速模式的优化 SPR共振角度偏移与流速关系图: 20 μL/min(D)△? = 0.48,50 μL/min(C)△? = 0.5, 60μL/min出信号后调整为20 μL/min(A)△?=0.58,80μL/min出信号后调整20μL/min(B)△?=0.54 3.结果与讨论检测池温度优化 在实验过程中，温度也是一个重要的影响因素。在SPR生物传感器中，最常见的待测物质为生物分子的水溶液，其折射率受温度的影响与纯水类似，在同一波长下，随着温度的升高，水折射率逐渐减小，且温度越高，减小的幅度越大。所以对于对比试验，应设置相同的检测池温度，此外，本实验所使用的芬兰BioNavis公司生产的SPR Navi 200型表面等离子体共振生物传感器的可设置温度范围为低于室温5 ℃或高于室温15 ℃，但经过多次试验总结，温度过高或过低均易导致检测池漏气，影响检测效果，所以一般实验时温度设为高于室温2℃左右。 3.结果与讨论生物条码两种探针DNA比例的优化 3.结果与讨论选择性检测 3.结果与讨论SPR对于凝血酶的检测 3.结果与讨论SPR检测体系的实用性研究 Au纳米粒子的制备 生物条码的制备 基底的修饰 滚环复制扩增 放大体系的连接 SPR在线检测凝血酶 2.实验步骤 3.结果与讨论 实验的可行性检验 SPR检测凝血酶的可行性: 空白(C), 1 × 10-12 mol/L的凝血酶， 不进行滚环放大（B）, 1 × 10-12 mol/L的凝血酶,滚环放大（A） 结论：C,B,A对应信号分别为：0.35，0.5，2.82，从而证明本实验的合理性以及滚环放大反应的有效性。 3.结果与讨论 反应温度的优化(C thrombin =1.0 × 10-13 mol/L) 结论：反应的最佳温度为37 ℃ 3.结果与讨论 体系聚合反应时间的优化(C thrombin =1.0 × 10-13 mol/L) 结论：体系的最佳反应时间为120 min 3.结果与讨论 聚合酶浓度的优化 结论：聚合酶最佳使用浓度为0.25 U/ml 3.结果与讨论 纳米金粒径的优化 结论：最终确定最佳的纳米金粒径为41.5 nm 结论：在凝血酶浓度为10-13 mol/L时，随着S4 : S3的值增大到20 : 1，信号提高至1.98，此后随着探针比例增大信号成下降趋势。最终确定探针比例为S4:S3 = 20 : 1 不同蛋白质的SPR响应信号：空白（Blank）；通入甲胎蛋白（AFP）；通入溶解酵素（lysozyme）；通入牛血清蛋白（BSA）；通入凝血酶（Thrombin），蛋白的浓度均为100 pg mL-1。 结论：利用凝血酶抗体与适体对于凝血酶的特异结合，用来检测凝血酶具有非常好的特异性 不同浓度的凝血酶对应的SPR角度变化 不同浓度的凝血酶与SPR角度的关系 结论：在凝血酶浓度为1×10-16 mol/L至1×10-11