细胞培养技术 教学课件 ppt 作者 兰容 周珍辉 主编 章静波 主审 实验部分6乳鼠肺细胞的原代培养.pptVIP

实验六 乳鼠肺细胞的原代培养 组织块培养法 一、实验目的 1．学习和掌握组织块培养法培养细胞的基本方法和操作过程。 2．进一步掌握动物细胞培养过程中的无菌技术。 3．掌握在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 二、实验原理 组织切成0.5-1mm 的小块后，由于组织块体积很小，在不加任何粘着剂的情况下，它们也能直接贴附于瓶壁上，然后细胞从组织块边缘向外长出生长晕，最后连接成片而形成单层细胞。此方法程序简化，是常用的原代细胞培养方法。 三、器材 超净工作台 二氧化碳培养箱 普通显微镜 倒置显微镜 酒精灯 吸管 培养瓶 解剖剪 眼科剪 烧杯 镊子（尖头、圆头和弯头） 四、试剂和材料 Hanks液 75％酒精 RPMI－1640培养液 (含小牛血清及青、链霉素) 新生乳鼠（小鼠） 五、操作 （一）取材 1、取新生乳鼠一只。 2、采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠浸入盛有75%酒精的烧杯中2-3秒（默数5下）。 3、随即携入超净工作台内，小鼠仰位放置到灭菌的培养皿中。 4、用75％酒精消毒胸廓部位皮肤。 5、打开消毒器械包，在胸廓正中线位处，用眼科弯镊夹起乳鼠胸部皮肤（多夹些）,用解剖剪开适当位点后,用两把眼科弯镊向左右两侧撕拉，皮肤外翻固定，充分暴露躯干部肌肉（注意：不要使表皮面接触到已暴露出来的胸腹肌）。酒精消毒乳鼠胸廓后，换一套金属器械，沿着隔膜剪断胸廓，并将胸骨两侧肋骨剪断。胸廓暴露后，可见跳到的心脏和粉红色的肺。换一把弯头眼科镊，将弯头向下，从心脏右上方插入心肺连接处，轻轻向上用力，将心肺一齐取出，放置在灭菌的培养皿中，用镊子去除心脏，肺移入已加Hanks液的青霉素瓶内。 （二）漂洗 用Hanks液清洗肺脏表面血污，然后用眼科直剪粗剪几下，再用Hanks液漂洗多次，去净血污，将洗净的组织块置青霉素小瓶一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余液体。 （三）剪切 用眼科直剪将洗净的组织块反复剪成0.5-1立方毫米的小块，此过程需20～30分钟（剪切时为保持组织湿润，可向组织块滴加1～2滴培养液）。然后用吸管滴加几滴培养液，轻轻吹打混匀。 （四）接种和培养 用润湿的吸管分次吸取小碎块悬液，注意吸在吸管前端部，以免吸得过高，使组织小块粘附于管壁而丢失。将组织碎块在培养瓶底部均匀放置（块距0.3cm大小），25毫升培养瓶放20～30块为宜。然后轻轻翻转培养瓶，加入适量培养液(液层厚约15mm)盖好，标记好，置37℃孵箱中培养4-24小时。待组织小块略干燥，能牢固贴在瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡组织块，静置培养。操作过程中动作一定要轻，减少振动，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养。 （五）观察 静置培养3天后开始在显微镜下观察细胞生长情况。注意观察培养组织小块边缘是否长出新细胞。一般最先出现的是形态不规则的游走细胞,接着是成纤维细胞或上皮细胞。当细胞分裂，细胞数量增多时，在组织块周围可见到生长晕。随后细胞生长分裂增快，呈放射状向外扩展逐渐连成一片。 注意检查有否污染。 可根据培养液颜色，更换培养液。 约10-15天后细胞可长成单层，即可传代培养。 * *