细胞培养技术 教学课件 ppt 作者 兰容 周珍辉 主编 章静波 主审 实验部分4动物细胞培养用液的配制和无菌处理.pptVIP

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实验四 动物细胞培养用液的配制和无菌处理 一、实验目的 1.掌握配制细胞基础培养液(RPMI-1640、DMEM等)的方法和操作要求。 2.掌握抗菌素、消化液及Hanks液的配制方法。 3.进一步学习无菌操作,练习各实验器材的使用方法。 4.练习细胞用液分装方法。 二、实验用品 试管架、记号笔、圆头镊、广口瓶 火柴、1000mL烧杯、不锈钢正压滤器 针头滤器、大、小滤膜、一次性注射器 玻璃注射器 三、操作 (一)Hanks液的配制 配方: 甲液:NaHPO4·2H2O 0.06克 KH2PO4 0.06克 MgSO4·7H2O 0.20克 葡萄糖 1.00克 NaCl 8.00克 三蒸水 750毫升 乙液:CaCl2 0.14克 三蒸水 100毫升 配制程序: 1、将乙液徐徐加入甲液中。 2、将0.35克NaHCO3溶解在37℃100毫升三蒸水中。 3、用数滴NaHCO3液溶解0.01克酚红。 4、将2、3液逐滴、搅拌加入到1液中。 5、用三蒸水定容至1000毫升,充分混匀,4℃冰箱过夜。 6、滤过消毒,小瓶分装,冷藏。 配制注意事项: 配制时各种药品要依次溶解 含Ca2+和Mg2+的物质因容易出现沉淀,配制时要单独溶解,然后在不断搅拌下加入。 (二)血清的灭活处理 1、选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。 2、对照瓶内放入与血清等体积的水。 3、对照瓶内插入准确的温度计,放入水浴锅中,接通电源,调节温度控制钮,使温度计温度保持在56℃。 4、血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴锅中,待温度计所示温度上升至56℃时,定时30min。 5、大瓶血清灭活后,进行分装。 6、分装后,抽样做无菌试验,-20℃~-70℃保存。 (三)0.25%胰蛋白酶的配制 1、称取0.25克酶粉,用少量已消毒的D-Hanks液将胰蛋白酶粉调成糊状。 2、加适量已消毒的D-Hanks液,磁力搅拌3~5天即可溶解(室温和4℃间断进行,室温高于30℃要减少酶液在室温中的搅拌时间),溶解完全后定容至100mL。 3、溶解后的酶液(深红色)滤过除菌,分装,-20℃冻存。 (四)RPMI-1640的配制 1、溶解培养基:将干粉培养基溶于总量1/3的三蒸水中,再用水洗包装袋内面两次,倒入培养液中。振荡或超声助溶,一般不要加热助溶。 2、补加试剂:根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3(2.0g)、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。 3、加抗生素:一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml,链霉素100U/ml。市售青霉素为80万U/瓶,可溶于4ml体积,每一升培养液中加0.5ml即可。市售链霉素为100万U/瓶,可溶于5ml体积,每一升培养液中也加0.5ml即可。 (四)RPMI-1640的配制 4、调pH值:加水到900ml(在需要加10%小牛血清的情况下),然后用5%NaHCO3调节pH到7.2,加水定容到终体积(必要时用1 mol/L 盐酸和1 mol/L 氢氧化钠调节pH)。 5、过滤除菌:宜采用0.45um和0.22um滤膜各一张,上层为0.45um,下层为0.22um,以保证过滤效果。注意滤膜正面(光面)朝上。过滤后分装于小瓶中(100或200ml)。 6、加小牛血清:根据培养基配制的量将小牛血清分装,冷冻保存(-20℃)。临用前加入小牛血清(10%~20%)。 四、注意事项 1、新鲜三蒸水应贮存与棕色磨口试剂瓶中,三蒸水存放时间不要超过两周,最好现制现用。 2、培养液配好后,应先抽取少许放入培养瓶内,于37℃温箱内置24~48hr,以检测培养液是否有污染。 3、每次配液量以两周左右为宜,一次配液不要太多,防止营养成分损失或者污染。 ? 实验安排 第一组:1)Hanks液的配制和分装:分装在100mL的培养瓶中,每瓶50mL,剩余的装在盐水瓶中。2)值日:领取DMEM培养基、Hepes、青霉素、链霉素、5mL一次性注射器10~15根;蒸三蒸水。 第二组: 1)Hanks液的配制和分装:同上。2)10月19号(下星期三)完成CO2培养箱和无菌室的消毒工作;解冻分装好的小牛血清;培养瓶的灭菌工作。 实验安排 第三组:胰蛋白酶液的配制和分装:分装在25mL的培养瓶中,每瓶15mL,剩余的装在小盐水瓶中。 第四组:1)小牛血清的灭活和分装:分装在25mL的培养瓶中,每瓶12.5mL,剩余的仍装在小牛血清瓶中。2)准备酒精棉。 第五组:培养液的配制和分装:分装在100mL的培养瓶中,每

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