凋亡研究进展及检测研究生的课件.ppt

TUNEL法：（原位凋亡检测试剂盒） 1）检测原理： 凋亡产生的断裂的DNA-----TdT酶标记dUTP-Biotin-----结合链霉亲和素-HRP-----作用于底物DAB显色 4、DNA Ladder 试剂盒 1）检测原理: DNA片段化 激活核酸内切酶 核小体连接区发生DNA降解， 寡核小体片段（160～200bp的倍数) 检测材料与方法: 细胞或新鲜组织，裂解——蛋白酶和RNA酶消化——提取DNA片段——琼脂糖电泳 检测结果: 琼脂糖电泳图片 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）对细胞进行染色，凋亡细胞由于总DNA量降低，于正常G0/G1细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰（sub-G1）即细胞凋亡群 5、DNA含量分析 DNA Damage 2N 4N 2N 4N G1 S G2/M 6、细胞凋亡的分子水平检测方法 1）Caspase分子的检测 2）线粒体膜势能的检测 JC-1 3）凋亡相关分子的检测 促凋亡分子 抑凋亡分子 4）相关信号通路分子的检测 1）Caspase分子的检测 Caspase3、8和9，2，6等 Caspase检测方法 ①分光光度法检测 ②FACS检测 ③Western Blot检测 全长检测 剪切体检测 3）凋亡相关分子的检测 促凋亡分子 Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid, AIF,Apaf-1和cytochrome c等 抑制凋亡分子 Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等 端粒酶活性检测试剂盒 氧化应激系列检测 4）相关信号通路分子的检测 抗凋亡信号通路 PI3K-Akt pathway NIK-NF-kB pathway 促凋亡信号通路 MKK-JNK pathway Fas-FADD pathway P53 pathway 五、凋亡分析总体原则及解决方案 1）因为凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；所以需进行多指标同时检测； 2)由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；而每个指征维持有一个时间段，所以需要在不同的时间点进行采样，以保证检测结果的准确性； 3）实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现假阳性或者假阴性。 六、常见问题及解决方法 1 试验前阶段 凋亡指标的选择及实验方案的设计 A 实验材料：类型与数量 B 仪器条件 C 研究经费 D 论文水平 2 试验阶段 A 自备试剂浓度，配制方法 B 操作经验及注意事项 C 根椐具体材料的试验条件优化 3 结果分析 A 阴性：没结果 B 阳性：假阳性 C 结果不明显 D 结果异常 Thank You! * Apaf-1 functions by cleaving procaspase-9, after binding to cytochrome c, and generating the active form, casp9, which goes on to stimulate downstream factors (Eberhardt and Schulz, 2003). Caspase-9, shown in panel c, requires the association with a regulatory subunit such as Apaf-1. This caspase-9/Apaf-1 complex forms a haloenzyme, which is often referred to as an apoptosome, and is thought to represent the true active form of the caspase-9. Initiator caspases are activated via the mechanisms shown in panel’s b and c through regulated protein-protein interactions. There are two major apoptotic pathways in mammalian cells, as shown in the diagram below. The left arrows on fig 2 indicate the External Signal Pathway, a