昆虫sf9细胞培养.docxVIP

Sf9培养要点： 温度：27-28摄氏度 pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加 传代时间：72h（三天左右） 细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。（以上来自invitrogen） 细胞特点：规则的带有颗粒球形。贴壁紧。 标准条件的定义： 培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL 传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。 贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。形成单层细胞可以传代培养 悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个 Sf9悬浮培养所需要的细胞数 培养基：sf-900 Ⅲ SFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量） 培养瓶与培养体积： 冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。 1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。细胞可是悬浮或贴壁培养； 2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记； 3. 室温400-600×g离心10min。移除上清。 4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞； 5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中； 6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h； 7. 储存于液氮中。 转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。 载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50% Sf900 = 2 \* ROMAN II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900 = 2 \* ROMAN II来大量表达蛋白 Sf900 = 2 \* ROMAN II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害）） 当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。 细胞培养的一般顺序：复苏——传代——传代稳定——冻存 应当遵循的一般过程：复苏——贴壁培养——悬浮——悬浮扩大培养（产生目标蛋白） （也可不经过贴壁培养，直接悬浮培养） 贴壁时间：45min 悬浮的转速：80rpm 附：离心机rcf与g的换算： 无血清培养基可以选择性加入一定的抑菌剂防止细菌或者真菌污染： 培养基：GIBCO-SFM900 加青霉素链霉素抑制细菌生长两性霉素B抑制真菌生长