miRNA205过表达载体的构建及其对猪诱导性多能-南京医科大学.PDF

第38卷第6期 南京医科大学学报（自然科学版） 2018年6月 ACTAUNIVERSITATISMEDICINALISNANJING（NaturalScience） ·713 · miRNA⁃205过表达载体的构建及其对猪诱导性多能干细胞建 系的作用 陈俏羽，赵丽华，陈 袁，张曼玲，侯道荣，姜海滨，王俊政，刘曼菱，王晨宇，尤志欢，李荣凤* 南京医科大学江苏省异种移植重点实验室，江苏 南京 211166 ［摘 要］ 目的：构建miRNA⁃205过表达载体并研究miRNA⁃205对猪诱导多能干细胞系建立的影响。方法：对本实验室已建 系的猪primed胚胎干细胞、猪内细胞团细胞及猪胎儿成纤维细胞三者之间进行miRNA表达谱的分析比较，利用PCR扩增miRNA⁃ 205前体序列，并将其克隆于基础表达载体pCAGDNA3⁃hFat1，构建过表达载体pCAG⁃miR205。使用脂质体转染技术将该载体转 染到已转基因修饰的猪胎儿成纤维细胞（含有鼠源干细胞多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c⁃Myc）。利用干细胞培养液诱导培 养建立猪诱导性多能干细胞系。通过实时荧光定量PCR检测转染前后细胞内miRNA⁃205的表达情况，比较分析miRNA⁃205对猪 诱导性多能干细胞的建系效率的影响。结果：成功构建了pCAG⁃miR205过表达载体；相较于未转染细胞，转染该载体细胞的miR⁃ NA⁃205表达量显著升高（P＜0.01）；利用干细胞培养液诱导后培养转染组的诱导性多能干细胞克隆长出率高于未转染细胞组。 结论：研究结果表明在细胞水平上过表达microRNA⁃205，可提高猪诱导性多能干细胞建系效率；已构建的miRNA⁃205过表达载体 将有助于在后续研究中建立稳定表达miRNA⁃205的细胞系，为进一步深入研究miRNA⁃205在干细胞重编程和多能性维持中的作 用机制打下基础。 ［关键词］ 猪；miRNA⁃205；诱导多能干细胞 ［中图分类号］ R329.2 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007⁃4368（2018）06⁃713⁃08 doi：10.7655/NYDXBN Construction of miRNA⁃205 overexpression vector and its effect on porcine induced pluripotentstemcellestablishment ChenQiaoyu，ZhaoLihua，ChenYuan，ZhangManling，HouDaorong，JiangHaibin，WangJunzheng，LiuManling， WangChenyu，YouZhihuan，LiRongfeng* JiangsuKeyLaboratoryofXenotransplantation，NMU，Nanjing211166，China ［Abstract］ Objective： ToconstructamiRNA⁃205overexpressionvectorandstudytheeffectofmiRNA⁃205ontheestablishmentof porcineinducedpluripotentstemcelllines（iPSCs）. Methods：WecomparedmiRNAtranscriptionalprofilesbetweentheprimed porcineembryonicstemcells（primedPESCs），porcineinnercellmass（ICM）andpigfetalfibroblastcells（PEF）.ThemiRNA⁃205 precursorsequencewasamplifiedbyPCRandintegratedintotheexpressionvectorpCAGDNA3⁃hFat1toconstructtheoverexpression vectorpCAG⁃miR205.Theexpressionvectorwastransfectedintoporcinefetalfibroblastscontainingfourmousederivedtranscription factors（Oct4，Sox2，Klf4andc⁃Myc）bylipofectaminetransfection