质粒DNA的提取 碱裂解法.ppt

质粒DNA的提取; 什么是质粒(plasmid)? 细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状DNA分子。 ;目的要求;实验原理;质粒DNA的提取和纯化步骤;1.溶液I（pH8.0,50mol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCL，10mmol/L1EDTA ) 2.溶液II （pH12.6, 1% SDS , 0.2mol/L NaOH) 3.溶液III（pH4.8,5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml) 4.苯酚/氯仿/异戊醇:25:24:1 5.无水乙醇 6.70%乙醇 7.TE液（pH8.0,10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA,含20ug/ml Rnase A） ;质粒DNA的小量制备（碱裂解法） 过夜培养液1.5mL,8000RPM离心2min，收集菌体 溶液I （葡萄糖、 TE、 EDTA )100uL重悬菌体 溶液II （SDS 、 NaOH)200uL 轻柔颠倒混匀 溶液III（乙酸钾、冰乙酸) 150uL,颠倒混匀,冰浴5min 8000rpm离心5min、吸取上清液于新的EP管中， 加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇混合液 8000rpm离心5min，上清液加入2-2.5倍体积无水乙醇，冰浴10min 10000rpm离心10min???弃上清，沉淀加入70%乙醇1mL 10000rpm离心5min，弃上清，沉淀干燥 得到的质粒DNA用TE液（含Rnase A ）溶解，消化RNA即得不含RNA的质粒DNA，用于酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定。;注意事项;思考题;EDTA的作用是: 抑制Dnase的活性, 降低细胞膜的稳定性 SDS的作用是: 溶解细胞膜和核膜, 并使蛋白变性 酚的作用是: 变性沉淀蛋白,抑制DNase的活性 氯仿的作用是:加速有机相和水相分层 异戊醇的作用是：消除因蛋白质变性而产生的泡沫，从而稳定两相界面 pH8.0的Tris溶液（TE）的作用是:保证抽提时DNA进入水相, pH8.0可防止DNA变性 无水乙醇作用: (在有盐的条件下)沉淀核酸 70%乙醇作用: 去除共沉淀的盐;实验报告要求;实验报告按下列要求书写