第九章 核酸等温扩增技术.ppt

第九章 核酸等温扩增技术 核酸等温扩增技术的定义及特点 核酸等温扩增技术是一类分子生物学技术的总称，它们能在某一特定的温度下扩增特定的DNA或者RNA。 与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求。 核酸等温扩增技术的分类 环介导等温扩增技术（LAMP） 依赖于核酸序列的扩增技术（NASBA） 滚环扩增技术（RCA） 单引物等温扩增技术（SPIA） 依赖于解旋酶的等温扩增技术（HAD） 链替代扩增技术（SDA） 快速等温检测放大技术（RIDA） 切刻内切酶核酸恒温扩增技术（NEMA） 环介导等温扩增技术（LAMP） 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是2000年日本研究人员Notomi等发明的一种新型体外等温扩增特异性核酸片段的技术。 该技术主要利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，从而保证引物可以在等温条件下顺利与模板结合，并进行链置换扩增反应。 LAMP的特点 LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。 15-60min内可扩增出109-1010倍靶序列拷贝，得到500ug/ml的目的DNA。具有简单、快速、特异性强的特点。 LAMP引物设计 主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 扩增原理 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。 扩增分两个阶段 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合。在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。 第2阶段 是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。 产物检测的原理 电泳分析 荧光检测 浑浊度检测 LAMP扩增产物电泳分析 肉眼观察LAMP结果 LAMP的优点 操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。 快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成。 高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。 LAMP的缺点 依赖于核酸序列的扩增 依赖于核酸序列的扩增（nucleic