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赖氨酸的发酵工艺 一、赖氨酸概述 赖氨酸是一种碱性氨基酸,是仅次于谷氨酸的第二大氨基酸产品,是谷物蛋白的第一限制性氨基酸,在谷物食料中添加适量的赖氨酸,其蛋白质的生物价大大提高。 赖氨酸的应用范围很广。①作为食品强化剂;②作为药物可用作肝细胞再生剂,对改善肝功能,治疗肝硬化、高氨症,增进食欲、改善营养状况有明显的疗效;③作为饲料添加剂,在畜、禽类的饲料中添加少许的赖氨酸,对家禽、家畜的日增重、料肉比、家禽的产卵量等方面效果尤为显著。 二、赖氨酸性质 2,6-二氨基己酸 C6H14O2N2 游离赖氨酸易与空气中的二氧化碳结合,都是以盐酸盐的形式存在 熔点 263 ℃ 比旋光度 +21° 0 ℃ 溶解度 53.6g/100ml 三、国内外赖氨酸发酵概况 L-赖氨酸是继L-谷氨酸之后用微生物方法大量投产的氨基酸。 目前,世界上赖氨酸的总生产能力约60万t/年,产量约38—41万t/年。美国ADM公司是目前世界上最大的赖氨酸生产企业,现有生产能力15.89万t /年,占世界市场的40%以上。日本味之素公司,生产能力9.08万t/年 。日本协和发酵公司总能力约6万t/年该公司计划将其赖氨酸生产能力扩大到10万t /年,争取将赖氨酸的市场份额增长到30%以上。 六十年代中期我国开始进行L-赖氨酸菌株选育和发酵研究。我国是赖氨酸消费增长最快的国家,已经成为世界上赖氨酸第二大消费国,有巨大的市场容量和良好的市场前景。目前,我国较大的赖氨酸生产企业有5家以上,能力已达6.5万t /年。但受国外赖氨酸进口的冲击,产量不足4万t/年。 赖氨酸合成途径的调节机制 ①谷氨酸优先合成,谷氨酸合成过剩就会抑制谷氨酸脱氢酶(GD)的活性,使得生物合成的代谢流转向天门冬氨酸。天门冬氨酸的过剩也会抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性,使得天门冬氨酸不致大量积累。 ②赖氨酸的前体物质天门冬氨酸与乙酰辅酶A的生成形成平衡合成,乙酰辅酶A的增加能逆转天门冬氨酸对其自身合成的反馈抑制。 ③天门冬氨酸激酶(AK)受赖氨酸与苏氨酸的协同反馈。AK是一个变构酶,催化天门冬氨酸和ATP形成α-天门冬氨酸磷酸,有两个变构位置可以接受末端产物。 AK受赖氨酸与苏氨酸的协同抑制,当 只有赖氨酸或苏氨酸与变构位置结合时,酶活影响不大,当赖氨酸与苏氨酸同时结合到两个变构位置时,酶活受到强烈的抑制。此外,AK是赖氨酸合成途径中唯一的反馈调节点。 ④赖氨酸亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁,赖氨酸分支途径的初始酶二氢吡啶二羧酸合成酶为亮氨酸所阻遏。 ⑤蛋氨酸比苏氨酸优先合成,蛋氨酸合成的过剩就会阻遏高丝氨酸-O-转乙酰酶,使得生物合成的代谢流转向苏氨酸。苏氨酸比赖氨酸优先合成,苏氨酸的过剩会反馈抑制高丝氨酸脱羧酶的活性,使得生物合成转向赖氨酸。 五、赖氨酸生产工艺流程图 六、赖氨酸生产菌种的选育改良思路 出发菌株:黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、嗜醋酸棒杆菌 育种思路 1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育 2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育:高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育:AEC 4.解除代谢互锁:Leu- 、 抗Leu结构类似物、 喹啉s 、 苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成: Ala-、抗Asp结构类似物 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株 6.改善细胞膜的透过机能 7. 选育温度敏感突变株 8. 应用细胞工程和基因工程育种 七、菌种培养 ⑴ 斜面菌种 一般用肉汤培养基或蛋白胨培养基 a 肉汤培养基 牛肉膏1%,蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,琼脂2%,pH7.0。 b 蛋白胨培养基 蛋白胨1%,酵母膏1%,氯化钠0.5%,pH7.2。 ⑵ 一级种子培养基(摇瓶种子培养基) a 肉汤培养基 牛肉膏1%,蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,pH7.0。 b 含葡萄糖的肉汤培养基 葡萄糖2%,蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化钠0.25%,pH7.0。 ⑶ 二级种子培养基、三级种子培养基以及发酵培养基 糖蜜2.0%、豆粉水解液0.5%、硫酸铵 0.4%、碳酸钙0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.04%、pH7.2 八、培养基 1)碳源 淀粉、麦芽糖、蔗糖和葡萄糖。赖氨酸产生菌均不能利用淀粉,只能利用葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖。 2)氮源 氮源可分为无机氮源和有机氮源。赖氨酸发酵中,二者均有使用 。 3)无机盐 磷盐 (磷酸氢二钾)、硫酸镁 、钾盐 (氯化钾或氢氧化钾 )、钙盐(碳酸钙或氯化钙 ) 4)生长因子 生物素含量在30μg/L以上较好、
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