菌种鉴定流程.ppt

药品微生物限度检查——控制菌检查 菌种分离鉴定流程 增菌 分纯 初步鉴别试验 革兰染色 生化试验 酶类试验 抗生素敏感性试验（用于菌种鉴定） 全面鉴定 血清分型 毒素分析 基因分型 蛋白组分析 自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等） 2 供试品的制备 参看药典微生物限度检查法 有抑菌活性的检品应进行预处理 稀释法 离心沉淀集菌法 3000r/min离心30min，有不溶性沉渣先500r/min离心5min 薄膜过滤法 0.45um± 0.02 100ml 中和法 磺胺类100ml中1~5ml1%对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯80 自然沉降法 难溶于水的抗菌制剂 同时做阳性和阴性对照 了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下面的试验 3 革兰染色、镜检 3.1 操作步骤 3.1.1 制片-过火固定，避免水冲，破坏细胞结构使染料易透过 3.1.2 结晶紫染色-1分 3.1.3 碘液媒染-1分 3.1.4 乙醇脱色-30秒 3.1.5 沙黄复染-30秒 3.2 染色结果 革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作质控株 3.3 革兰染色注意事项 3.2.1 玻片必须洁净 3.2.2 涂片菌量宜少，菌不可浓 3.2.3 新鲜培养物 3.2.4 脱色是关键 3.3 革兰染色意义 3.3.1 初步识别细菌，利于进一步鉴定 3.3.2 初步选择治疗用药物 3.3.3 与致病性相关，阳性以外毒素为主，阴性菌以内毒素为主 4 触酶试验 触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含有触酶可能导致假阳性出现 用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否利于在有氧环境中生长 细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢，具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生（链球菌，此试验可用于菌种鉴别） 5 氧化酶试验 5.1 试验方法：滤纸，无菌玻璃棒，1滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液 5.2 结果判定：30s，培养物出现粉红色逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应 试验阳性图示 5.3 氧化酶试验注意事项 5.3.1 试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠 5.3.2 试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒 5.3.3 试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用 5.3.4 反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反应 5.3.5 含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验，因为糖分解产酸抑制氧化酶活性 6 血浆凝固酶试验简介 主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定 分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶 检测以试管法为参考方法 6 凝固酶试验操作方法 无菌试管(10×100mm)3支，加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液(1：1) 各0.5ml，1支加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml，作为检品管；其余2支作对照管：1支加入金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对照；另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照 三管同时置36±1℃水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h 6 凝固酶试验的注意事项 血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维蛋白常已析出)易导致假阴性反应 用试管法检查时，轻轻将试管倾斜，(动作勿大，防止江凝块摇碎)仔细观察 试验时间过长容易导致假阴性 6 凝固酶试验的结果判定 阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应；不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验 目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、准确性 7 生化试验 细菌鉴定的传统方法，参考方法 因为针对不同菌种，选择有针对性的生化试验进行，菌种不同所作的试验不同，药品检验中常用的种类不再一一介绍，所以在以后各菌种鉴定内容当中单独讨论 所有试验都需要已知阳性和阴性的菌株作为质控菌株，定期对试剂、培养基（包括培养基的灵敏度试验）以及试验操作过程进行质控试验，保证结果解释的准确性 8 自动化仪器 优点： 包含的菌种的生物学特性测试试验种类更多，可以提高菌种鉴定的准确率 缩短菌种鉴定所需要的时间，为检品的快速检验提供保证 细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴定方法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更多的选择和便利 B-D公司的phenix系统、生物梅里埃公司的VITEK系统