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实验 利用流式细胞术分析细胞周期时相 细胞生物学实验 流式细胞术分析细胞周期时相 实验目的 实验原理 仪器、材料与试剂 实验步骤 实验报告及思考题 实 验 目 的 掌握流式细胞仪的工作原理 掌握用流式细胞仪测量细胞群体DNA含量分布的方法 了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用 实 验 原 理 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中,在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测,得到该细胞的光散射和荧光指标,分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。 细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化,如G0/G1期的DNA含量为2C,而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。 仪器、材料与试剂 仪器:流式细胞仪,细胞培养设备,离心机,水浴,冰箱 材料:HeLa细胞,5ml注射器,离心管,封口膜,微量移液器,Tips 试剂:70%乙醇(保存于4℃),RNase-A (10mg/ml,-20℃保存), PI (650μg/ml,避光保存于-20℃),PBS(pH 7.4,保存于4℃) 实 验 步 骤 取对数生长期细胞,倒去培养液,胰酶适度消化细胞,用培养液吹打,800rpm , 离心 15 min去上清。 PBS洗2次,加0.5mL PBS吹匀,务必吹散。 用5mL注射器将细胞吸起,用力打入5mL 70%(预冷)乙醇中,封口膜封口。4℃固定过夜(可长至2周) 800rpm 15min收集固定细胞,PBS洗2次 用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打(防止细胞破碎) 加RNase-A约3μL至终浓度约为50μg/mL ,37℃水浴消化30 min; 加PI约50μL至终浓度约为65μg/mL ,在冰浴中避光染色30 min。 用300目(孔径40~50微米)尼龙网过滤,上机检测 样品分析测定及打印 实 验 报 告 及 思 考 题 实验报告 标明你所测定的样品中各周期时相的百分比? 思考题 流式细胞术在科学研究中的应用 本实验为何要采用对数生长期的细胞? * * 细胞周期时相分析 细胞周期时相分析 细胞周期时相分析 细胞周期时相分析 细胞周期时相分析 *
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