凝胶层析法测蛋白质分子量资料.docVIP

蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 实验目的 了解凝胶层析的原理及其应用。 通过测量蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。 了解洗脱曲线、选择曲线的意义，并学会绘制洗脱曲线、选择曲线。 实验原理 蛋白质分子量的测定 蛋白质是生命过程中最重要的物质之一 , 近年来已成为生命科学领域的研究热点[1] 。分子量是蛋白质的主要特征参数之一, 当发现一种新的蛋白质时, 首先应准确测定其分子量。蛋白质分子量的测定方法有多种, 如渗透压法、光散射法、超速离心法、凝胶层析法及聚丙烯酰胺凝胶电泳等[2-4]。 凝胶层析法 层析法，又称色层分析法或色谱法（Chromatography），在1903-1906年由俄国植物学家M.Tswett首先提出。虽然近年来质谱技术日益成熟,灵敏度、精确度也为各种方法之首，但是目前在实验室中测量蛋白质分子量应用比较广泛的还是凝胶层析等方法[5]。 凝胶层析法（gel filtration），又叫凝胶过滤法、凝胶渗透色谱法 (GPC )、排阻色谱法、凝胶过滤色谱法(GFC)、分子筛层析法（molecular sieve chromatography）等[6]，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。 凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 由于其分离条件温和、 样品回收率高、实验的重复性高、设备简便经济等特点，是目前最广泛使用的生化物质的分离方法之一，是所有色谱技术中 最简单、条件最温和的方法，且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。 虽然其分离效果不及高效液相色谱，但可作为一种初步的分离手段使下一步的纯化达到更好的效果[7]。 凝胶 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很微细的多孔网状结构。常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是葡聚糖（dextran，商品名为SePhadex），凝胶型号不同，孔隙度不同，但都不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 测量方法 凝胶过滤层析, 是一种分离不同大小分子的分配层析, 被分离物质的分子在溶剂和限定孔径的凝胶固定相中被分配, 混合物随流动相流经层析柱时, 各种物质同时进行着垂直向下的运动和无定向的扩散运动, 混合物中各物质因相对分子质量的大小不同而被分离, 这种方法操作简便, 费用较低, 重复性好[8]。因其能像筛子一样筛分不同大小的分子，因此又称为“分子筛”。其具有许多良好的性能，因此在蛋白质的分离分析中被广泛采用。经过不少人的实际应用和完善，该方法已经变成一种可靠的测定高分子分子量的方法[9]。 将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。Vt由三部分组成，即Vt=Vo+Vi+Vg。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积。 而洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系为： Ve=Vo+Kd·Vi Ve是自加入样品时起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；本实验凝胶层析柱中填充的是交联葡聚糖，含有蛋白的溶液通过管柱时，大分子的蛋白呈正态分布连续首先流出，会形成一个蛋白峰[10]。Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。Kd可通过实验求得： Kd=（Ve- Vo）/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（带颜色为佳，便于观察，如血红蛋白、印度黑墨水等，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为