蛋白质沉淀反应实验.docVIP

蛋白质的沉淀反应 一、目的和要求 1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2、掌握几种沉淀蛋白质的方法 3、了解蛋白质变性与沉淀的关系 二、沉淀反应 （一）原理 在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。但这种稳定的状态是有条件的。在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型： 1、可逆沉淀反应 沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显著变化。在沉淀因素去除后，又可恢复其亲水性，这种沉淀反应就是可逆沉淀反应，也叫做不变性沉淀反应。属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。 2、不可逆沉淀反应 蛋白质在沉淀的同时，其空间结构发生大的改变，许多副键发生断裂，即使除去沉淀因素，蛋白质也不会恢复其亲水性，并丧失生物活性，这种沉淀反应就是不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 （二）盐析 1、材料与试剂 （1）10%的卵清蛋白溶液（要求新鲜配制）、浓蛋白溶液（2）饱和硫酸铵溶液 （3）固体硫酸铵 （4）滤纸、玻棒 2、操作方法 （1）取试管一支，加入浓蛋白溶液2ml，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置10分钟将出现沉淀。此沉淀物为球蛋白。 （2）取上清液于另一支试管。 （3）向上清液液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻棒搅拌，直至粉末不再溶解为止。静置数分钟后，沉淀析出的是清蛋白。 （4）向两支试管中分别加水，观察其沉淀是否溶解。 （三）重金属盐沉淀 重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag2+ 等可与蛋白质分子上的羟基结合生成不溶性金属盐而沉淀： 重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上用蛋白质解除重金属盐引起的食物中毒。 1、材料与试剂 （1）10%的卵清蛋白溶液（2）0.1mol/L氢氧化钠溶液 （3）3%硝酸银溶液 （4）0.1%硫酸铜溶液 （6）试管3支 2、操作方法 （1）取试管2支，分别编号后各加入1ml 10%的卵清蛋白溶液。 （2）各管再加入一滴0.1mol/L氢氧化钠溶液。 （3）向1管加3%硝酸银溶液3～4滴；向2管加0.1%硫酸铜溶液3～4滴。混匀后观察沉淀的生成。 （四）生物碱试剂沉淀反应 生物碱试剂能与蛋白质分子中的氨基结合生成不溶性沉淀，反应如下： 1、材料与试剂 （1）10%的卵清蛋白溶液 （2）5%三氯乙酸溶液 2、操作方法 取试管一支，加10%的卵清蛋白溶液20滴后再加入5%三氯乙酸溶液10滴，混匀后观察沉淀的出现。 （五）有机溶剂沉淀反应 1、材料与试剂 （1）10%的卵清蛋白溶液 （2）95%乙醇溶液 2、操作方法 取试管1支，加10%的卵清蛋白溶液10滴后，再加入95%乙醇溶液20滴，边加边混匀。静置片刻后观察结果。 习 题 1、盐析时为什么分别用饱和硫酸铵溶液和硫酸铵粉末？ 2、重金属盐沉淀蛋白质注意什么？